Идентификация редких антиген-специфических Т-клеток из легких мышей с помощью пептид:Тетрамеры основного комплекса гистосовместимости

В основе адаптивной иммунной системы лежит способность Т-клеток распознавать и реагировать на определенный антиген. Когда и где Т-клетка реагирует на родственный ей антиген, определяет баланс инфекции и аутоиммунитета, гомеостаза и рака, здоровья и болезни¹. Из этого следует, что изучение Т-клеток в конкретном контексте иммунитета должно быть сосредоточено на клетках, специфичных к соответствующему антигену, представляющему интерес. К числу технологических достижений, которые значительно расширили возможности по освидетельствованию антиген-специфических популяций Т-клеток, относятся флуоресцентно меченые растворимые мультимеры (обычно тетрамеры) молекул основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II, интегрированные в антигенные пептидные эпитопы, более известные как «пептид: тетрамеры MHC»2,3,4,5 . Представляя собой естественные лиганды Т-клеточных антигенных рецепторов (TCR), тетрамеры пептида:MHC класса I и класса II обеспечивают средства для прямой идентификации антиген-специфических CD8⁺ и CD4⁺ Т-клеток соответственно в эндогенном репертуаре Т-клеток в иммунной системе без необходимости ответа на стимуляцию антигена в анализе. Тетрамеры представляют собой более элегантный подход к изучению антиген-специфичных Т-клеток, чем модели адаптивного переноса трансгенных Т-клеток TCR⁶, и все чаще используются для идентификации чужеродных и собственных антиген-специфических популяций Т-клеток как в экспериментальных моделях мышей, так и в моделях заболеваний человека ^4,5.

В то время как тетрамеры могут легко идентифицировать высокочастотные популяции Т-клеток, которые разрослись в ответ на стимуляцию антигена, их использование для наивных, самоантиген-специфичных Т-клеток или Т-клеток памяти ограничено очень низкими частотами этих^{популяций.} Наша группа и другие разработали и популяризировали стратегии магнитного обогащения на основе тетрамеров, которые увеличивают чувствительность обнаружения, что позволяет изучать эти клеточные популяции в лимфоидных тканях мышей 8,9,10,11.

Появление тканевых резидентных Т-клеток в этой области поставило повышенный акцент на разработку новых способов исследования Т-клеток в нелимфоидном пространстве. Как и многие другие поверхности слизистых оболочек, Т-клетки в легких сталкиваются с рядом собственных и чужеродных антигенов, полученных из эпителия хозяина, комменсальных и инфекционных микробов, а также объектов окружающей среды, включая аллергены. Транскрипционный анализ Т-клеток, полученных из нелимфоидной ткани (НЛТ), демонстрирует фенотип, подобный памяти, который несет уникальную тканеспецифическую судьбу и функцию, часто направленную на транспортировку и тканевый гомеостаз¹². Более того, тканевые резидентные Т-клетки памяти (Trms), как правило, более клонально ограничены, чем те, которые находятся^{в циркуляции}. Определение того, как и почему антигены стимулируют проживание Т-клеток в NLT, имеет решающее значение для понимания того, как иммунная система защищает от инфекции, поддерживает гомеостаз тканей и, иногда, переходит в аутоиммунную систему. Тем не менее, по-видимому, наблюдается больший истирание среди тканевых резидентных Т-клеток легких по сравнению с другими NLT¹⁴. Соответственно, возможность идентификации и характеристики эндогенных Т-клеток легкого с заданной антиген-специфичностью ограничена присущей им редкостью.

Комбинируя использование методов обогащения клеток на основе магнитных шариков и окрашивание пептидом:тетрамером MHC, нам удалось обнаружить расширенные, но редкие аутоантиген-специфические Т-клетки в легких мышей^15,16. В этой статье мы представляем подробное описание протокола, который мы оптимизировали для надежной изоляции и характеристики любой популяции редких антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мышей (Рисунок 1). Этот протокол включает в себя стадию окрашивания антителами in vivo для отличия резидентных в ткани Т-клеток от сосудистых Т-клеток¹⁷, за которыми следуют два различных метода обработки легочной ткани для учета имеющихся ресурсов. Затем следует этап общего магнитного обогащения Т-клеток, окрашивание тетрамером и анализ с помощью проточной цитометрии. Жизнеспособность клеток и окрашивание тетрамерами дополнительно усиливаются в этом протоколе за счет добавления аминогуанидина, который блокирует индуцируемый апоптоз Т-клеток, индуцируемый активацией оксида азота (iNOS)¹⁸, и дазатиниба, который ограничивает подавление TCR¹⁹. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и легко адаптируется для различных последующих анализов. Несмотря на то, что наивные Т-клетки вряд ли будут обнаружены в легких, мы считаем, что этот протокол будет особенно полезен для изучения собственных антиген-специфических Т-клеток и Trm в легких.

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса протокола. Легкие собирают у мышей и диссоциируют на отдельные клетки. Образцы затем обогащают для Т-клеток перед окрашиванием тетрамисами пептида:МНС и флуоресцентно меченными антителами для проточного цитометрического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.