유세포분석(Flow Cytometry)에 의한 Pyroptosis의 검사
Summary
이 논문에서는 닭 GSDME(chGSDME-NT) 및 요오드화 프로피듐(PI)의 N 말단 단편에 대한 항체로 이중 염색 후 유세포 분석을 사용하여 발열 세포를 식별하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
Pyroptosis는 주로 GSDM(cleaved Gasdermin) 계열 단백질에서 생성된 N-말단에 의한 원형질막 공극의 형성에 의해 유발되는 염증성 유형의 프로그램된 세포 사멸입니다. 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의한 멤브레인 부착 GSDM-NT 검사는 발톱증을 평가하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 이 방법을 사용하여 pyroptosis가 있는 세포를 다른 형태의 세포 사멸과 구별하는 것은 어렵습니다. 이 연구에서는 감염성 점액낭 질환 바이러스(IBDV)에 감염된 DF-1 세포를 모델로 사용하여 닭 GSDME(chGSDME-NT)의 N-말단 단편에 대한 특이 항체 및 요오드화 프로피듐(PI) 염색에 대한 특이 항체를 활용하여 유세포 분석을 통해 pyroptosis를 겪는 세포의 비율을 정량화했습니다. chGSDME-NT 양성 세포는 Alexa Fluor 647 표지된 항-chGSDME-NT 항체를 사용하여 유세포 분석으로 쉽게 검출할 수 있었습니다. 또한, IBDV에 감염된 세포에서 chGSDME-NT/PI 이중 양성 세포의 비율(약 33%)은 모의 감염 대조군(P < 0.001)보다 유의하게 높았습니다. 이러한 결과는 유세포 분석에 의한 막 결합 chGSDME-NT의 검사가 세포 사멸을 겪고 있는 세포 중에서 발열 세포를 결정하는 효과적인 접근법임을 나타냅니다.
Introduction
Pyroptosis는 주로 포유류 1,2,3에서 Gasdermin (GSDM) D에 의한 원형질막 기공의 형성에 의존하는 프로그램된 세포 사멸의 염증성 유형입니다. 닭 4,5에서 GSDMD의 유전적 결핍으로 인해 닭에서 pyroptosis의 메커니즘은 파악하기 어려운 상태로 남아 있습니다. Gasdermin 계열은 GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME 및 DFNB59 3,6을 포함한 보존 단백질로 구성됩니다. 연구에 따르면 teleost 물고기와 오리의 GSDME는 caspase-1/3/7 또는 caspase-3/7에 의해 절단되어 발열 세포 사멸을 유도합니다 7,8. 그러나 닭의 병원성 감염에 대한 숙주 반응에서 GSDME 매개 pyroptosis의 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.
전염성 점액낭 질환(IBD)은 IBDV9에 의해 유발되는 급성, 전염성이 높은 면역 억제성 가금류 질병입니다. IBDV는 비외피(non-enveloped bi-segmented double-stranded, ds) RNA 바이러스로, Birnaviridae과(10)에 속하는 Avibirnavirus 속에 속합니다. 다른 연구자들과 우리 실험실의 이전 연구에 따르면 IBDV 감염은 다른 경로를 통해 숙주 세포에서 세포 사멸을 유도합니다 11,12,13,14. 이전 연구 결과는 IBDV 감염이 용해 세포 사멸의 지표인 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출을 유발한다는 것을 보여주었으며 6,15, 이는 IBDV 감염이 숙주 세포에서 용해 세포 사멸을 유도한다는 것을 시사합니다. 또한, 이 데이터는 IBDV에 감염된 세포가 원형질막에서 불어오는 큰 기포를 동반한 세포 팽창 및 프로피듐 요오드화물(PI) 양성 염색을 포함하여 발열성 세포 사멸의 형태학적 특징을 나타내며, 이는 IBDV 감염이 세포에서 발열증을 유발한다는 것을 시사합니다.
절단된 GSDM(GSDM-NT)의 N-말단 단편에 의한 발열세포 내 막의 형성이 발화증의 특징이라는 점을 고려할 때, 이론적으로는 특정 항체를 사용하여 세포막의 GSDM-NT를 검사하여 유세포법으로 발열세포를 검출할 수 있습니다. 조류 발열 세포에서 닭 Gasdermin E(chGSDME-NT)의 N-말단 단편은 막 공극을 형성하여 프로피듐 요오드화물(PI)이 DNA를 통과하여 결합할 수 있도록 합니다. 따라서, 유세포 분석을 사용하여 pyroptotic cell의 비율을 검출할 수 있으며, 이에 따라 pyroptosis를 apoptosis 및 necrosis와 같은 다른 형태의 세포 사멸과 구별할 수 있습니다. 그러나 유세포 분석에 의한 발열 세포를 검사하는 방법은 보고되지 않았습니다. 이 연구에서는 DF-1 세포를 IBDV에 감염시키고 유세포 분석을 수행하여 chGSDME-NT 단편(막 결합) 및 PI 염색에 대해 단클론 항체(McAb)를 사용하여 열세포 세포를 검사했습니다. 놀랍게도, pyroptotic cell은 유세포 분석에 의해 효과적으로 검출되었습니다. 또한, pyroptotic cell의 비율을 정량화할 수 있었습니다. 이러한 발견은 pyroptosis를 결정하는 강력하고 효과적인 수단을 제공합니다.
이 글에서는 anti-chGSDME-NT McAb 및 PI 염색을 사용하여 유세포 분석으로 IBDV에 감염된 세포의 pyroptosis를 검사하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 또한 다른 병원체에 감염된 세포로 확장될 수 있으며 pyroptosis가 있는 다양한 세포 유형을 검사하는 데 적용되어 다른 형태의 세포 사멸과 구별할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 글에서는 Alexa Fluor 647 표지된 anti-chGSDME-NT McAb 및 PI로 감염된 세포를 이중 염색하여 얻은 유세포 분석을 사용하여 pyroptosis를 검사하는 효과적인 방법에 대해 설명합니다. 이 접근법은 또한 pyroptosis를 apoptosis 및 necrosis와 같은 다른 유형의 세포 사멸과 구별하기 위해 다양한 세포 유형에 적용될 수 있습니다.
포유류 1,2,3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
친절한 도움을 주신 Jue Liu 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가중점연구개발프로그램(No. 2022YFD1800300), 중국국가자연과학재단(No. 32130105), 현대농업산업기술연구시스템(No. CARS-40), 중국.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
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