Examen de la pyroptose par cytométrie en flux
Summary
Cet article décrit l’identification des cellules pyroptotiques à l’aide de la cytométrie en flux après double coloration avec des anticorps contre le fragment N-terminal de la GSDME de poulet (chGSDME-NT) et l’iodure de propidium (PI).
Abstract
La pyroptose est un type inflammatoire de mort cellulaire programmée principalement due à la formation de pores de la membrane plasmique par l’extrémité N-terminale générée par les protéines de la famille des gasdermines clivées (GSDM). L’examen de la GSDM-NT attachée à la membrane par Western Blot est la méthode la plus couramment utilisée pour évaluer la pyroptose. Cependant, il est difficile de différencier les cellules atteintes de pyroptose des autres formes de mort cellulaire en utilisant cette méthode. Dans cette étude, des cellules DF-1 infectées par le virus de la bursite infectieuse (IBDV) ont été utilisées comme modèle pour quantifier la proportion de cellules subissant une pyroptose par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps spécifiques contre le fragment N-terminal de la coloration GSDME de poulet (chGSDME-NT) et l’iodure de propidium (PI). Les cellules positives pour chGSDME-NT étaient facilement détectables par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps anti-chGSDME-NT marqués au Fluor 647. De plus, la proportion de cellules doublement positives chGSDME-NT/PI dans les cellules infectées par l’IBDV (environ 33 %) était significativement plus élevée que chez les témoins infectés par un placebo (P < 0,001). Ces résultats indiquent que l’examen de la chGSDME-NT liée à la membrane par cytométrie en flux est une approche efficace pour déterminer les cellules pyroptotiques parmi les cellules en cours de mort cellulaire.
Introduction
La pyroptose est un type inflammatoire de mort cellulaire programmée qui dépend principalement de la formation de pores de la membrane plasmique par la gasdermine (GSDM) D chez les mammifères 1,2,3. En raison de la déficience génétique de la GSDMD chez les poulets 4,5, le mécanisme de la pyroptose chez les poulets reste insaisissable. La famille des gasdermines comprend des protéines conservées, notamment GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME et DFNB59 3,6. Des études ont rapporté que la GSDME des poissons téléostéens et des canards est clivée par la caspase-1/3/7 ou la caspase-3/7 pour induire la mort cellulaire pyroptotique 7,8. Cependant, le rôle de la pyroptose médiée par la GSDME dans la réponse de l’hôte aux infections pathogènes chez les poulets reste à élucider.
La bursite infectieuse (MICI) est une maladie aiguë, hautement contagieuse et immunosuppressive de la volaille causée par le VCI9. L’IBDV, un virus à ARN double brin (ds) bi-segmenté non enveloppé, appartient au genre Avibirnavirus de la famille des Birnaviridae10. Des études antérieures menées par d’autres personnes et par notre laboratoire ont montré que l’infection par le virus de l’IBDV induit la mort cellulaire dans les cellules hôtes par différentes voies 11,12,13,14. Des résultats antérieurs ont démontré que l’infection par l’IBDV déclenche la libération de lactate déshydrogénase (LDH), un indicateur de la mort des cellules lytiques 6,15, suggérant que l’infection par l’IBDV induit la mort des cellules lytiques dans les cellules hôtes. De plus, les données montrent que les cellules infectées par l’IBDV présentent des caractéristiques morphologiques de la mort cellulaire pyroptotique, notamment un gonflement cellulaire avec de grosses bulles soufflant de la membrane plasmique et une coloration à l’iodure de propidium (PI) positive, ce qui suggère que l’infection par l’IBDV induit une pyroptose dans les cellules.
Étant donné que la formation de pores membranaires dans les cellules pyroptotiques par le fragment N-terminal de GSDM clivé (GSDM-NT) est une caractéristique de la pyroptose, théoriquement, les cellules pyroptotiques pourraient être détectées par cytométrie en flux en examinant GSDM-NT sur la membrane cellulaire à l’aide d’anticorps spécifiques. Dans les cellules pyroptotiques aviaires, le fragment N-terminal de la gasdermine E de poulet (chGSDME-NT) forme des pores membranaires, permettant à l’iodure de propidium (PI) de passer à travers l’ADN et de le lier. Ainsi, la proportion de cellules pyroptotiques peut être détectée à l’aide de la cytométrie en flux, distinguant ainsi la pyroptose d’autres formes de mort cellulaire, telles que l’apoptose et la nécrose. Cependant, la méthode d’examen des cellules pyroptotiques par cytométrie en flux n’a pas été rapportée. Dans cette étude, les cellules DF-1 ont été infectées par l’IBDV, et la cytométrie en flux a été réalisée pour examiner les cellules pyroptotiques à l’aide d’anticorps monoclonaux (McAb) contre le fragment chGSDME-NT (lié à la membrane) et la coloration PI. Étonnamment, les cellules pyroptotiques ont été efficacement détectées par cytométrie en flux. De plus, la proportion de cellules pyroptotiques a pu être quantifiée. Ces résultats fournissent un moyen puissant et efficace de déterminer la pyroptose.
Cet article décrit une méthode d’examen de la pyroptose dans des cellules infectées par l’IBDV par cytométrie en flux à l’aide de la coloration anti-chGSDME-NT, McAb et PI. Cette méthode peut également être étendue à d’autres cellules infectées par des agents pathogènes et appliquée pour examiner divers types de cellules atteintes de pyroptose, en les distinguant des autres formes de mort cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode efficace d’examen de la pyroptose à l’aide de la cytométrie en flux, obtenue par double coloration des cellules infectées avec Alexa Fluor 647, anti-chGSDME-NT, McAb et PI. Cette approche peut également être appliquée à divers types de cellules pour différencier la pyroptose d’autres types de mort cellulaire, tels que l’apoptose et la nécrose.
La pyroptose, un type inflammatoire de mort cellulaire programmée dépendant principalemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Jue Liu pour son aimable aide. Cette étude a été soutenue par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de la Chine (n° 2022YFD1800300), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32130105) et du Fonds réservé pour le système de recherche technologique de l’agro-industrie moderne (n° 2022YFD1800300). CARS-40), Chine.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
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