Elucidando # 946; -1,3-glucanase e propriedades físico-químicas da peroxidase do mecanismo de defesa da parede celular do trigo contra a infestação por Diuraphis noxia
Summary
O presente protocolo descreve procedimentos utilizados para estudar e caracterizar enzimas relacionadas à parede celular, principalmente β-1,3-glucanase e peroxidase, em plantas de trigo. Seus níveis de atividade aumentam durante a interação trigo-RWA e estão envolvidos na resposta de defesa da planta por meio do reforço da parede celular, o que impede a alimentação de pulgões.
Abstract
Plantas de trigo infestadas por pulgões do trigo russo (RWA) induzem uma cascata de respostas de defesa, incluindo as respostas de hipersensibilidade (HR) e indução de proteínas relacionadas à patogênese (PR), como β-1,3-glucanase e peroxidase (POD). Este estudo tem como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas do POD associado à parede celular e da β-1,3-glucanase e determinar seu sinergismo na modificação da parede celular durante a interação RWASA2-trigo. As cultivares suscetíveis Tugela, moderadamente resistente Tugela-Dn1 e resistente Tugela-Dn5 foram pré-germinadas e plantadas em casa de vegetação, adubadas 14 dias após o plantio e irrigadas a cada 3 dias. As plantas foram infestadas com 20 indivíduos partenogenéticos do mesmo clone RWASA2 no estádio de 3 folhas, e as folhas foram colhidas de 1 a 14 dias após a infestação. O fluido de lavagem intercelular (IWF) foi extraído por filtração a vácuo e armazenado a -20 °C. Os resíduos das folhas foram triturados em pó e usados para componentes da parede celular. A atividade e caracterização do POD foram determinadas usando substrato de guaiacol 5 mM e H2O2, monitorando a mudança na absorbância a 470 nm. A atividade da β-1,3-glucanase, o pH e as condições ótimas de temperatura foram demonstrados medindo-se os açúcares redutores totais no hidrolisado com reagente DNS usando substratos de β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, medindo a absorbância a 540 nm e usando a curva padrão de glicose. O pH ótimo foi determinado entre pH 4 a 9, temperatura ótima entre 25 e 50 °C e estabilidade térmica entre 30 °C e 70 °C. A especificidade do substrato β-1,3-glucanase foi determinada a 25 °C e 40 °C usando substratos de coalhada e cevada β-1,3-1,4-glucana. Além disso, o modo de ação da β-1,3-glucanase foi determinado usando laminaribiose para laminaripentaose. Os padrões do produto de hidrólise de oligossacarídeos foram analisados qualitativamente com cromatografia em camada delgada (TLC) e quantitativamente analisados com HPLC. O método apresentado neste estudo demonstra uma abordagem robusta para infestar trigo com RWA, extração de peroxidase e β-1,3-glucanase da região da parede celular e sua caracterização bioquímica abrangente.
Introduction
Os pulgões do trigo russo (RWA) infestam o trigo e a cevada, causando perda significativa de rendimento ou redução da qualidade do grão. O trigo responde à infestação induzindo várias respostas de defesa, incluindo o aumento dos níveis de atividade da β-1,3-glucanase e peroxidase nas cultivares resistentes, enquanto as cultivares suscetíveis reduzem a atividade dessas enzimas no período inicial da infestação 1,2,3,4. As principais funções da β-1,3-glucanase e POD na planta de trigo incluíram a regulação do acúmulo de calose na cultivar resistente e a extinção de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular e regiões apoplásticas durante a infestação por RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 demonstraram que houve uma forte correlação entre o aumento da atividade do POD e o aumento do teor de lignina na cultivar de trigo resistente após infestações por RWASA2. Além disso, o aumento do teor de lignina indicou que a parede celular da cultivar de trigo resistente infestada foi reforçada, levando à redução da alimentação com RWA.
A maioria dos grupos de pesquisadores extraiu e estudou a β-1,3-glucanase apoplástica e a POD durante a interação trigo/cevada-RWA; além disso, a maioria desses estudos afirmou que essas enzimas influenciam a parede celular da planta de trigo infestada com RWA sem medir a presença da enzima na região da parede celular. Apenas alguns estudos usaram técnicas microscópicas para mostrar que os níveis de atividade da β-1,3-glucanase estavam ligados à regulação da calose 7,8,9 ou extraíram os principais componentes da parede celular para demonstrar a correlação entre as atividades do POD e a modificação da parede celular no resistente 6,10. A falta de sondagem da associação β-1,3-glucanase e POD à parede celular indica a necessidade de desenvolver métodos que permitam aos pesquisadores medir diretamente as enzimas ligadas à parede celular.
O método atual propõe que é necessário remover o fluido apoplástico do tecido foliar antes de extrair as enzimas ligadas à parede celular. O procedimento de extração do fluido apoplástico deve ser realizado duas vezes do tecido foliar, que é usado para extrair as enzimas ligadas à parede celular. Esse processo reduz a contaminação e a confusão das enzimas apoplásticas com as encontradas nas regiões da parede celular. Assim, neste estudo, extraímos POD ligado à parede celular, β-1,3-glucanase e β-glucanase específica para MLG e realizamos sua caracterização bioquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O trigo e a cevada são culturas de cereais frequentemente infestadas por espécies de pulgões, incluindo pulgões russos do trigo (Diuraphis noxia)7,24. Plantas de trigo resistentes induzem a regulação positiva das atividades de POD e β-1,3-glucanase como respostas de defesa durante todo o período de infestação para modificar a parede celular regulando o acúmulo de calose e lignina 6,25,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa recebeu financiamento da NRF-Thuthuka (Número de referência: TTK2204102938). S.N. Zondo recebeu a bolsa de pós-graduação da National Research Foundation para seu mestrado. Os autores agradecem ao Instituto Agricultural Research Council – Small Grain (ARC-SG) por fornecer as sementes utilizadas neste estudo. Quaisquer opiniões, descobertas e recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e, portanto, os financiadores não aceitam qualquer responsabilidade em relação a isso.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
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