#946;-1,3-Glucanase 및 Peroxidase Physicochemical 특성 Diuraphis noxia 감염에 대한 밀 세포벽 방어 메커니즘 설명
Summary
본 프로토콜은 밀 식물에서 주로 β-1,3-glucanase 및 peroxidase와 같은 세포벽 관련 효소를 연구하고 특성화하는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 그들의 활동 수준은 밀-RWA 상호 작용 중에 증가하며 세포벽 강화를 통해 식물 방어 반응에 관여하여 진딧물 먹이를 억제합니다.
Abstract
러시아 밀 진딧물(RWA)에 감염된 밀 식물은 과민 반응(HR) 및 β-1,3-glucanase 및 peroxidase(POD)와 같은 발병 관련(PR) 단백질의 유도를 포함한 일련의 방어 반응을 유발합니다. 이 연구는 세포벽 관련 POD와 β-1,3-glucanase의 물리화학적 특성을 특성화하고 RWASA2-wheat 상호 작용 중 세포벽 변형에 대한 시너지 효과를 결정하는 것을 목표로 합니다. 감수성이 있는 투겔라(Tugela), 적당히 저항성이 있는 투겔라-Dn1(Tugela-Dn1) 및 저항성이 있는 투겔라-Dn5(Tugela-Dn5) 품종을 온실 조건에서 미리 발아시키고 심었으며, 심은 후 14일 후에 비료를 주고 3일마다 관개했습니다. 식물은 3 잎 단계에서 동일한 RWASA2 클론의 20 개의 parthenogenetic 개체로 감염되었으며, 잎은 감염 후 1 일에서 14 일에 수확되었습니다. 세포간 세척액(IWF)을 진공 여과를 사용하여 추출하고 -20°C에서 보관했습니다. 잎 잔류물을 분말로 분쇄하여 세포벽 구성 요소에 사용했습니다. POD 활성 및 특성 분석은 5mM guaiacol 기질 및H2O2를 사용하여 측정하고 470nm에서 흡광도 변화를 모니터링했습니다. β-1,3-글루카나제 활성도, pH 및 온도 최적 조건은 β-1,3-글루칸 및 β-1,3-1,4-글루칸 기질을 사용하여 DNS 시약으로 가수분해물 내 총 환원당을 측정하고, 540nm에서 흡광도를 측정하고, 포도당 표준 곡선을 사용하여 입증되었습니다. pH 최적은 pH 4 내지 9 사이에서, 온도 최적은 25 내지 50°C, 열 안정성은 30°C 내지 70°C 사이에서 결정하였다. β-1,3-글루카나제 기질 특이성은 25°C 및 40°C에서 커드란 및 보리 β-1,3-1,4-글루칸 기질을 사용하여 결정하였다. 또한, β-1,3-글루카나제 작용 모드는 라미나리바이오오스 대 라미나리펜타오스를 사용하여 측정하였다. 올리고당 가수분해 산물 패턴은 박층 크로마토그래피(TLC)로 정성적으로 분석하고 HPLC로 정량적으로 분석했습니다. 이 연구에서 제시된 방법은 밀에 RWA를 감염시키고 세포벽 영역에서 과산화효소 및 β-1,3-글루카나아제를 추출하고 포괄적인 생화학적 특성을 분석하기 위한 강력한 접근 방식을 보여줍니다.
Introduction
러시아 밀 진딧물(RWA)은 밀과 보리를 감염시켜 상당한 수확량 손실이나 곡물 품질 저하를 일으킵니다. 밀은 저항성 품종에서 β-1,3-glucanase 및 peroxidase 활성 수준을 증가시키는 것을 포함하여 여러 방어 반응을 유도하여 감염에 반응하는 반면, 감수성 품종은 초기 감염 기간 1,2,3,4에서 이러한 효소의 활성을 감소시킵니다. 밀 식물에서 β-1,3-glucanase 및 POD의 주요 기능에는 저항성 품종의 callose 축적을 조절하고 RWA 감염 1,3,5,6,7 동안 세포벽 및 아포플라스틱 영역에서 활성산소종(ROS)을 담금질하는 것이 포함되었습니다. Mafa et al.6은 RWASA2 감염 시 저항성 밀 품종에서 증가된 POD 활성과 증가된 리그닌 함량 사이에 강한 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 또한, 리그닌 함량이 증가하면 감염된 저항성 밀 품종의 세포벽이 강화되어 RWA 수유량이 감소했음을 나타냅니다.
대부분의 연구자 그룹은 밀/보리-RWA 상호 작용 동안 아포플라스틱 β-1,3-glucanase 및 POD를 추출하고 연구했습니다. 또한, 이러한 연구의 대부분은 이러한 효소가 세포벽 영역의 효소 존재를 측정하지 않고 RWA에 감염된 밀 식물의 세포벽에 영향을 미친다고 주장했습니다. β-1,3-glucanase 활성 수준이 callose regulation 7,8,9와 관련이 있음을 보여주기 위해 현미경 기술을 사용한 연구는 소수에 불과하며, 저항 성 6,10에서 POD 활성과 세포벽 변형 사이의 상관 관계를 입증하기 위해 주요 세포벽 구성 요소를 추출했습니다. β-1,3-glucanase 및 POD와 세포벽의 연관성을 조사하지 않았다는 것은 연구자들이 세포벽 결합 효소를 직접 측정할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있음을 나타냅니다.
현재의 방법은 세포벽에 결합된 효소를 추출하기 전에 잎 조직에서 아포소성 액체를 제거하는 것이 필요하다고 제안합니다. 아포플라스틱 유체의 추출 절차는 세포벽 결합 효소를 추출하는 데 사용되는 잎 조직에서 두 번 수행해야 합니다. 이 과정은 세포벽 영역에서 발견되는 효소와 아포플라스틱 효소의 오염 및 혼동을 줄입니다. 따라서 본 연구에서는 세포벽 결합 POD, β-1,3-글루카나아제, MLG 특이적 β-글루카나아제를 추출하여 이들의 생화학적 특성 분석을 수행하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
밀과 보리는 러시아 밀 진딧물(Diuraphis noxia)을 포함한 진딧물 종에 자주 감염되는 곡물 작물입니다.7,24. 저항성 밀 식물은 감염 기간 동안 방어 반응으로 POD 및 β-1,3-glucanase 활성의 상향 조절을 유도하여 callose 및 lignin 축적을 조절함으로써 세포벽을 수정합니다 6,25,26,27.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa는 NRF-Thuthuka (참조 번호 : TTK2204102938)로부터 자금을 지원받았습니다. S.N. Zondo는 석사 학위로 National Research Foundation 대학원 장학금을 받았습니다. 저자들은 이 연구에 사용된 씨앗을 제공한 ARC-SG(Agricultural Research Council – Small Grain) 연구소에 감사를 표합니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 결과 및 권장 사항은 저자의 것이므로 자금 제공자는 이와 관련하여 어떠한 책임도 지지 않습니다.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
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