Élucidation des propriétés physicochimiques de la #946 ;-1,3-glucanase et de la peroxydase du mécanisme de défense de la paroi cellulaire du blé contre l’infestation par Diuraphis noxia
Summary
Le présent protocole décrit les procédures utilisées pour étudier et caractériser les enzymes liées à la paroi cellulaire, principalement la β-1,3-glucanase et la peroxydase, chez les plants de blé. Leurs niveaux d’activité augmentent lors de l’interaction blé-RWA et sont impliqués dans la réponse de défense des plantes par le renforcement de la paroi cellulaire, ce qui dissuade l’alimentation des pucerons.
Abstract
Les plants de blé infestés par des pucerons russes du blé (RWA) induisent une cascade de réponses de défense, y compris les réponses d’hypersensibilité (HR) et l’induction de protéines liées à la pathogenèse (PR), telles que la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD). Cette étude vise à caractériser les propriétés physicochimiques de la POD et de la β-1,3-glucanase associées à la paroi cellulaire et à déterminer leur synergie sur la modification de la paroi cellulaire lors de l’interaction RWASA2-blé. Les cultivars sensibles Tugela, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant ont été prégermés et plantés en serre, fertilisés 14 jours après la plantation et irrigués tous les 3 jours. Les plantes ont été infestées de 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 au stade 3 feuilles, et les feuilles ont été récoltées 1 à 14 jours après l’infestation. Le liquide de lavage intercellulaire (IWF) a été extrait par filtration sous vide et stocké à -20 °C. Les résidus foliaires ont été broyés en poudre et utilisés pour les composants de la paroi cellulaire. L’activité et la caractérisation du POD ont été déterminées à l’aide d’un substrat de gaïacol de 5 mM et de H2O2, en surveillant la variation de l’absorbance à 470 nm. L’activité de la β-1,3-glucanase, le pH et les conditions optimales de température ont été démontrés en mesurant les sucres réducteurs totaux dans l’hydrolysat avec le réactif DNS à l’aide de substrats β-1,3-glucane et β-1,3-1,4-glucane, en mesurant l’absorbance à 540 nm et en utilisant la courbe étalon du glucose. Le pH optimal a été déterminé entre 4 et 9, la température optimale entre 25 et 50 °C et la stabilité thermique entre 30 °C et 70 °C. La spécificité du substrat de β-1,3-glucanase a été déterminée à 25 °C et 40 °C à l’aide de substrats de β-1,3-1,4-glucane de curdlan et d’orge. De plus, le mode d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide de la laminaribiose à la laminaripentaose. Les profils de produits d’hydrolyse des oligosaccharides ont été analysés qualitativement par chromatographie sur couche mince (CCM) et quantitativement par HPLC. La méthode présentée dans cette étude démontre une approche robuste pour infester le blé avec des actifs pondérés en roturier la rose, extraire la peroxydase et la β-1,3-glucanase de la région de la paroi cellulaire et leur caractérisation biochimique complète.
Introduction
Les pucerons russes du blé infestent le blé et l’orge, causant des pertes de rendement importantes ou une réduction de la qualité des grains. Le blé réagit à l’infestation en induisant plusieurs réponses de défense, notamment l’augmentation des niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase et de la peroxydase chez les cultivars résistants, tandis que les cultivars sensibles réduisent l’activité de ces enzymes au début de la période d’infestation 1,2,3,4. Les principales fonctions de la β-1,3-glucanase et du POD dans la plante de blé comprenaient la régulation de l’accumulation de callose dans le cultivar résistant et l’extinction des espèces réactives de l’oxygène (ROS) au niveau de la paroi cellulaire et des régions apoplasiques lors de l’infestation par les RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 ont démontré qu’il y avait une forte corrélation entre l’augmentation de l’activité du POD et l’augmentation de la teneur en lignine dans le cultivar de blé résistant lors d’infestations par RWASA2. De plus, l’augmentation de la teneur en lignine indique que la paroi cellulaire du cultivar de blé résistant infesté a été renforcée, ce qui a entraîné une réduction de l’alimentation en actifs pondérés en eau.
La plupart des groupes de chercheurs ont extrait et étudié la β-1,3-glucanase apoplasique et le POD au cours de l’interaction blé/orge-APR ; De plus, la plupart de ces études ont affirmé que ces enzymes influencent la paroi cellulaire du plant de blé infesté d’APR sans mesurer la présence d’enzymes dans la région de la paroi cellulaire. Seules quelques études ont utilisé des techniques microscopiques pour montrer que les niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase étaient liés à la régulation de la callose 7,8,9 ou ont extrait les principaux composants de la paroi cellulaire pour démontrer la corrélation entre les activités de la POD et la modification de la paroi cellulaire chez les 6,10 résistants. L’absence de sonde de l’association de la β-1,3-glucanase et de la POD à la paroi cellulaire indique la nécessité de développer des méthodes permettant aux chercheurs de mesurer directement les enzymes liées à la paroi cellulaire.
La méthode actuelle propose qu’il soit nécessaire d’éliminer le liquide apoplasique du tissu foliaire avant d’extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire. La procédure d’extraction du liquide apoplasique doit être effectuée deux fois à partir du tissu foliaire, qui est utilisé pour extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire. Ce processus réduit la contamination et la confusion des enzymes apoplasiques avec celles trouvées dans les régions de la paroi cellulaire. Ainsi, dans cette étude, nous avons extrait la POD, la β-1,3-glucanase liée à la paroi cellulaire et la β-glucanase spécifique de la MLG et effectué leur caractérisation biochimique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le blé et l’orge sont des cultures céréalières fréquemment infestées par des espèces de pucerons, y compris les pucerons russes du blé (Diuraphis noxia)7,24. Les plants de blé résistants induisent la régulation positive des activités POD et β-1,3-glucanase en tant que réponses de défense tout au long de la période d’infestation pour modifier la paroi cellulaire en régulant l’accumulation de callose et de lignine</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa a bénéficié d’un financement de la NRF-Thuthuka (numéro de référence : TTK2204102938). S.N. Zondo a reçu la bourse d’études supérieures de la National Research Foundation pour son diplôme de maîtrise. Les auteurs sont reconnaissants à l’Institut ARC-SG (Agricultural Research Council-Small Grains) de nous avoir fourni les semences utilisées dans cette étude. Toutes les opinions, conclusions et recommandations exprimées dans ce document sont celles de l’auteur ou des auteurs, et par conséquent, les bailleurs de fonds n’acceptent aucune responsabilité à cet égard.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
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