Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento

Las PBMC humanas son tipos de células versátiles que se utilizan para numerosos ensayos; Sin embargo, el rendimiento del aislamiento es a menudo una limitación en muchos laboratorios, incluidos los biobancos¹⁶. Anteriormente, el Biobanco Estatal de Salud de Nueva Gales del Sur aisló los PBMC utilizando el método de gradiente de densidad. Se investigó la automatización del método de separación en gradiente de densidad para aumentar la capacidad de procesamiento, pero se identificaron barreras para la implementación, incluyendo (i) el costo de un manipulador de líquidos con una unidad de centrifugación completamente automatizada, con el requisito adicional de una unidad HEPA para producir un producto estéril, (ii) personal capacitado para la programación y (iii) el tiempo requerido para las pruebas de protocolo. Por lo tanto, este estudio exploró métodos alternativos e identificó el kit de PBMC humano obtenido comercialmente que podría usarse para el procesamiento manual y automatizado. La esterilidad está garantizada ya que el equipo necesario para el procesamiento cabe dentro de una cabina de seguridad biológica estándar (longitud de 1,2 m). En este documento se detallan las modificaciones realizadas en el protocolo¹⁴ recomendado por el fabricante, para aumentar la eficiencia y reducir los costes de los reactivos sin sacrificar la calidad. Además, el protocolo del fabricante se amplió para detallar los pasos de las muestras del biobanco para futuras investigaciones, incluida la sangre completa (paso 1.2), el plasma (paso 2.2) y los glóbulos rojos (paso 2.5) alícuotas del tubo sanguíneo original, así como el recuento de células y la criopreservación.

En este estudio, se compararon tres protocolos de aislamiento de PBMC: separación en gradiente de densidad, aislamiento manual y automatizado basado en perlas. Se realizaron modificaciones al protocolo manual basado en perlas del fabricante, incluida la eliminación de la dilución de la capa leucocitaria antes del aislamiento de PBMC y la eliminación del requisito de rotura para las centrifugaciones, lo que permitió a los investigadores seguir un protocolo de aislamiento de PBMC adaptable, rentable y de alto rendimiento. En primer lugar, se utilizaron ocho muestras de sangre entera emparejadas para aislar las PBMC con el fin de comparar la separación en gradiente de densidad y la técnica manual basada en perlas. Es importante destacar que las distribuciones de la población celular, la viabilidad celular y la recuperación de PBMC no fueron significativamente diferentes entre los dos métodos comparados, como se muestra en la Figura 2A-F, la Figura 3A y la Figura 1 suplementaria, respectivamente. En los datos representativos, los recuentos celulares fueron mayores para el método de separación en gradiente de densidad utilizando el método de exclusión de azul de tripano, pero no cuando se utilizó un analizador de células hematológicas. La configuración del tipo de célula PBMC en el contador de células empleó un rango de diámetro de célula de 8-50 μm y, por lo tanto, los recuentos incluirán PBMC así como granulocitos (aproximadamente 12-15 μm de diámetro) cuando se utilice el método de exclusión de azul de tripano¹⁷. Si bien el contador de células hematológicas ofreció una mayor especificidad que el método de exclusión de azul de tripano, algunos cálculos de recuperación fueron superiores al 100%, lo que refleja el margen de error del instrumento (ver Figura complementaria 1). Por lo tanto, se recomienda que los investigadores apliquen una combinación de técnicas de recuento celular al comparar los rendimientos de los protocolos de aislamiento de PBMC, ya que la mayoría de las técnicas no ofrecen recuentos celulares diferenciales específicos y altamente sensibles. Además, no se realizaron ensayos para comparar la actividad funcional de las PBMC obtenidas por ninguna de las técnicas, lo cual es una limitación de nuestro análisis.

A continuación, se compararon los métodos manuales y automatizados basados en perlas, y no se identificaron diferencias significativas entre el rendimiento o la viabilidad de PBMC a partir de 8 muestras emparejadas (Figura 4A,B). Las poblaciones celulares no se compararon individualmente, ya que se utilizó el mismo cóctel de aislamiento de anticuerpos para ambos métodos. Es importante destacar que el tiempo de intervención para procesar 8 muestras se redujo de 43 min a 22 min utilizando el protocolo automatizado (Figura 4C). Si bien el rendimiento, la prevención del agotamiento de los técnicos y la consistencia del procesamiento de muestras se garantizan mediante la automatización, el costo de los reactivos y consumibles es significativamente más alto, 3-4 veces más que el método manual basado en cordones. Esto es después de hacer modificaciones al protocolo del fabricante para usar 1 mL de capa leucocitaria (de un volumen de sangre total de 10 mL) en lugar del rango recomendado de 2-5 mL (de un volumen de sangre total de 10 mL y/o más). Si el presupuesto es una limitación, optar por el método manual puede reducir el tiempo de procesamiento en ~25% mientras se mantienen los costos de reactivos y consumibles comparables a los del método de separación por densidad. Se recomienda procesar no más de 8 muestras a la vez por técnico para garantizar un escalonamiento adecuado de las muestras (~30 s/muestra) dentro de los períodos de incubación de 5 minutos (pasos 3.7, 3.11 y 3.14).

Tanto en los métodos manuales como en los automatizados basados en perlas, la eliminación de la capa leucocitaria es un paso crítico para garantizar un aislamiento óptimo de PBMC. Es importante tener en cuenta que en este protocolo se utiliza una capa leucocitaria en lugar de sangre entera, ya que el volumen de los reactivos se basa en los volúmenes¹⁰ del material de partida. Eliminar de manera efectiva todo el volumen del pelaje leucocitario puede ser un desafío técnico. Inicialmente, este método detallaba la eliminación de 0,5 mL de capa leucocitaria, sin embargo, se aumentó a 1 mL para mejorar la recuperación. Para garantizar una recuperación adecuada y consistente del pelaje leucocitario, es importante detallar este proceso en la documentación del protocolo y la capacitación. Se recomienda agitar la punta de una pipeta mientras se aspira la capa leusulista, teniendo cuidado de no aspirar demasiados glóbulos rojos de la capa inferior (paso 2.3). Es importante no saturar el cóctel de anticuerpos que se une a las células no deseadas (es decir, granulocitos y glóbulos rojos), lo que puede afectar el rendimiento y la pureza¹⁰. Para minimizar los glóbulos rojos recolectados durante la extracción del pelaje leucocitario, la punta de la pipeta debe estar entre la capa de plasma y la capa del pelaje leucovita. El volumen del pelaje leucocitario se puede aumentar a partir de 1 mL; sin embargo, se debe tener cuidado como se describió anteriormente para asegurarse de que no más del 10% del volumen recolectado contenga glóbulos rojos. Alternativamente, se puede usar un manipulador de líquidos automatizado para recolectar pelajes leucocitarios de manera constante¹⁸. Sin embargo, las horas dedicadas necesarias para calibrar y solucionar problemas de los protocolos de los instrumentos de manipulación de líquidos, especialmente teniendo en cuenta el gasto, pueden no ser factibles para la mayoría de los laboratorios.

La transición y la aplicación del protocolo automatizado basado en perlas fue esencial dado el objetivo del NSW Health Statewide Biobank de procesar 23,000 PBMC durante los próximos 3 años. Aquí, se demostró que las PBMC se pueden aislar de los tubos de ACD hasta 9 días después de la recolección con una viabilidad media >70%. Si bien los rendimientos fueron óptimos 24 horas después de la recolección, el procesamiento dentro de este período de tiempo no siempre es factible, ya que es posible que sea necesario transportar las muestras. Se demostró que las PBMC aisladas con el método manual o automatizado basado en perlas pueden tener rendimientos de >3 x 10⁵ células/ml de sangre total cuando se aíslan dentro de los 4 días posteriores a la recolección y >1 x 10⁵ células/mL de sangre total cuando se aíslan dentro de los 10 días posteriores a la recolección. Los números bajos de muestras de más de 5 días se señalan como una limitación de este análisis. Además, los datos no se separaron en función de las edades, el sexo y el historial clínico de los participantes, ya que esta información no estaba disponible. Aunque se necesita un análisis comparativo para examinar los efectos de los retrasos en los tiempos de procesamiento de ambos métodos, se ha informado previamente que los retrasos en el aislamiento de PBMC utilizando el método de gradiente de densidad disminuyen la calidad celular y aumentan significativamente la contaminación por glóbulos rojos^19,20. Además, las proporciones de granulocitos aumentan si se retrasa el procesamiento y, por lo tanto, los especímenes de “edades” similares deben agruparse para los análisis posteriores 20,21,22. Cabe destacar que este experimento se realizó utilizando sangre anticoagulada con dextrosa cítrica ácida (es decir, citrato trisódico, ácido cítrico y dextrosa); sin embargo, el rendimiento y/o la proporción de los tipos celulares pueden variar si se utilizan otros anticoagulantes²³; por lo tanto, se aconseja a los investigadores que elijan un anticoagulante adecuado en función de los análisis de PBMC previstos.

En resumen, se detalla un protocolo para el aislamiento de PBMC mediante perlas magnéticas que es adaptable a flujos de trabajo de alto rendimiento para cumplir con los requisitos de escalado sin comprometer la viabilidad de la celda. Tanto los métodos manuales como los automatizados se pueden optimizar para producir concentraciones celulares específicas cambiando los volúmenes de arranque y resuspensión. El Biobanco Estatal de Salud de Nueva Gales del Sur ha pasado de extraer ~ 60 PBMC por mes utilizando la técnica tradicional de separación en gradiente de densidad a ~ 300 PBMC por mes utilizando este método basado en cuentas compatible con la automatización. El próximo objetivo de los autores es utilizar la plataforma automatizada para procesar hasta 1200 PBMC por mes y comparar aún más las PBMC aisladas mediante técnicas basadas en perlas magnéticas (manuales y automatizadas) y de gradiente de densidad para guiar la implementación de esta técnica a otros laboratorios, con un enfoque particular en los biobancos.