Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

Le PBMC umane sono tipi cellulari versatili utilizzati per numerosi saggi; Tuttavia, la produttività dell’isolamento è spesso un limite in molti laboratori, comprese le biobanche¹⁶. In precedenza, la NSW Health Statewide Biobank ha isolato le PBMC utilizzando il metodo del gradiente di densità. L’automazione è stata studiata per il metodo di separazione a gradiente di densità per aumentare la capacità di elaborazione, ma sono stati identificati ostacoli all’implementazione, tra cui (i) il costo di un gestore di liquidi con un’unità di centrifugazione completamente automatizzata, con l’aggiunta del requisito di un’unità HEPA per produrre un prodotto sterile, (ii) personale addestrato per la programmazione e (iii) tempo necessario per i test del protocollo. Pertanto, questo studio ha esplorato metodi alternativi e ha identificato il kit PBMC umano ottenuto commercialmente che potrebbe essere utilizzato per l’elaborazione manuale e automatizzata. La sterilità è garantita in quanto l’attrezzatura necessaria per la lavorazione si inserisce all’interno di una cabina di sicurezza biologica standard (lunghezza di 1,2 m). Questo documento descrive in dettaglio le modifiche apportate al protocollo¹⁴ raccomandato dal produttore, per aumentare l’efficienza e ridurre i costi dei reagenti senza sacrificare la qualità. Inoltre, il protocollo del produttore è stato esteso per dettagliare i passaggi dei campioni della biobanca per la ricerca futura, tra cui il sangue intero (fase 1.2), il plasma (fase 2.2) e i globuli rossi (fase 2.5) che vengono aliquotati dalla provetta di sangue originale, nonché il conteggio delle cellule e la crioconservazione.

In questo studio, sono stati confrontati tre protocolli di isolamento PBMC: separazione del gradiente di densità, isolamento manuale e automatizzato basato su perline. Sono state apportate modifiche al protocollo manuale basato su microsfere del produttore, tra cui la rimozione della diluizione del buffy coat prima dell’isolamento della PBMC e l’eliminazione della necessità di interruzione per le centrifugazioni, consentendo ai ricercatori di seguire un protocollo di isolamento PBMC adattabile, economico e ad alto rendimento. In primo luogo, sono stati utilizzati otto campioni di sangue intero abbinati per isolare le PBMC per confrontare la separazione in gradiente di densità e la tecnica manuale basata su microsfere. È importante sottolineare che le distribuzioni della popolazione cellulare, la vitalità cellulare e il recupero delle PBMC non erano significativamente diversi tra i due metodi confrontati, come mostrato rispettivamente nella Figura 2A-F, nella Figura 3A e nella Figura 1 supplementare. Nei dati rappresentativi, la conta cellulare era più alta per il metodo di separazione in gradiente di densità utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano, ma non quando è stato utilizzato un analizzatore cellulare ematologico. Le impostazioni del tipo di cellula PBMC sul contatore di cellule utilizzavano un intervallo di diametro cellulare di 8-50 μm e, pertanto, i conteggi includeranno PBMC e granulociti (circa 12-15 μm di diametro) quando si utilizza il metodo di esclusione del blu di tripano¹⁷. Sebbene il contatore di cellule ematologiche offrisse una specificità più elevata rispetto al metodo di esclusione del blu di tripano, alcuni calcoli di recupero erano superiori al 100%, riflettendo il margine di errore dello strumento (vedere la Figura 1 supplementare). Si raccomanda pertanto agli investigatori di applicare una combinazione di tecniche di conteggio cellulare quando confrontano i rendimenti dei protocolli di isolamento PBMC, poiché la maggior parte delle tecniche non offre conteggi cellulari differenziali sia specifici che altamente sensibili. Inoltre, non sono stati eseguiti saggi per confrontare l’attività funzionale delle PBMC prodotte da entrambe le tecniche, il che è una limitazione della nostra analisi.

Successivamente, sono stati confrontati i metodi manuali e automatizzati basati su perline e non sono state identificate differenze significative tra la resa o la vitalità della PBMC da 8 campioni abbinati (Figura 4A, B). Le popolazioni cellulari non sono state confrontate individualmente, poiché per entrambi i metodi è stato utilizzato lo stesso cocktail di isolamento anticorpale. È importante sottolineare che il tempo di elaborazione manuale di 8 campioni è stato ridotto da 43 minuti a 22 minuti utilizzando il protocollo automatizzato (Figura 4C). Mentre la produttività, la prevenzione del burnout dei tecnici e la coerenza dell’elaborazione dei campioni sono garantite dall’automazione, il costo dei reagenti e dei materiali di consumo è significativamente più elevato, 3-4 volte superiore rispetto al metodo manuale basato su microsfere. Questo dopo aver apportato modifiche al protocollo del produttore per utilizzare 1 mL di buffy coat (da un volume di sangue intero di 10 mL) invece dell’intervallo raccomandato di 2-5 mL (da un volume di sangue intero di 10 mL e/o superiore). Se il budget è un limite, optare per il metodo manuale può ridurre i tempi di lavorazione del ~25%, mantenendo i costi dei reagenti e dei materiali di consumo paragonabili a quelli del metodo di separazione per densità. Si consiglia di elaborare non più di 8 campioni alla volta per tecnico per garantire un adeguato scaglionamento dei campioni (~30 s/campione) entro i periodi di incubazione di 5 minuti (passaggi 3.7, 3.11 e 3.14).

Sia nei metodi manuali che in quelli automatizzati basati su microsfere, la rimozione del buffy coat è un passaggio fondamentale per garantire un isolamento ottimale della PBMC. È importante notare che in questo protocollo viene utilizzato un buffy coat piuttosto che sangue intero poiché il volume dei reagenti si basa sui volumi del materiale di partenza¹⁰. Rimuovere efficacemente l’intero volume del buffy coat può essere tecnicamente impegnativo. Inizialmente, questo metodo prevedeva la rimozione di 0,5 ml di buffy coat, ma è stato aumentato a 1 ml per migliorare il recupero. Per garantire un recupero adeguato e coerente del buffy coat, la descrizione dettagliata di questo processo è importante nella documentazione del protocollo e nella formazione. Si raccomanda di agitare il puntale di una pipetta durante l’aspirazione del buffy coat, facendo attenzione a non aspirare troppi globuli rossi dallo strato sottostante (passaggio 2.3). È importante non saturare il cocktail di anticorpi che lega le cellule indesiderate (cioè i granulociti e i globuli rossi), che possono influire sulla resa e sulla purezza¹⁰. Per ridurre al minimo i globuli rossi raccolti durante l’estrazione del buffy coat, la punta della pipetta deve trovarsi tra il plasma e lo strato di buffy coat. Il volume del buffy coat può essere aumentato da 1 mL; tuttavia, è necessario prestare attenzione come descritto sopra per garantire che non più del 10% del volume raccolto contenga globuli rossi. In alternativa, è possibile utilizzare un manipolatore automatico di liquidi per raccogliere i buffy coat in modo coerente¹⁸. Tuttavia, le ore dedicate necessarie per calibrare e risolvere i problemi relativi ai protocolli degli strumenti per la manipolazione dei liquidi, soprattutto considerando la spesa, potrebbero non essere fattibili per la maggior parte dei laboratori.

La transizione e l’applicazione del protocollo basato su microsfere di automazione è stata essenziale dato l’obiettivo della NSW Health Statewide Biobank di elaborare 23.000 PBMC nei prossimi 3 anni. Qui, è stato dimostrato che le PBMC possono essere isolate da provette ACD fino a 9 giorni dalla raccolta con vitalità medie >70%. Sebbene le rese siano state ottimali 24 ore dopo la raccolta, l’elaborazione entro questo lasso di tempo non è sempre fattibile in quanto potrebbe essere necessario trasportare i campioni. È stato dimostrato che le PBMC isolate con il metodo manuale o automatizzato basato su microsfere possono avere rese di >3 x 10⁵ cellule/mL di sangue intero se isolate entro 4 giorni dalla raccolta e di >1 x 10⁵ cellule/mL di sangue intero se isolate entro 10 giorni dalla raccolta. Numeri bassi per campioni superiori a 5 giorni sono considerati una limitazione di questa analisi. Inoltre, i dati non sono stati separati in base all’età, al sesso e alla storia clinica dei partecipanti, poiché queste informazioni non sono state rese disponibili. Sebbene sia necessaria un’analisi comparativa per esaminare gli effetti dei ritardi nei tempi di elaborazione per entrambi i metodi, è stato precedentemente riportato che i ritardi nell’isolamento delle PBMC utilizzando il metodo del gradiente di densità riducono la qualità delle cellule e aumentano significativamente la contaminazione da globuli rossi^19,20. Inoltre, le proporzioni dei granulociti aumentano se l’elaborazione viene ritardata e, quindi, i campioni di “età” simili dovrebbero essere raggruppati per le analisi a valle 20,21,22. Da notare che questo esperimento è stato eseguito utilizzando sangue anticoagulato con destrosio citrico acido (cioè citrato trisodico, acido citrico e destrosio); tuttavia, la resa e/o la proporzione dei tipi di cellule possono variare se vengono utilizzati altri anticoagulanti²³; pertanto, si consiglia agli investigatori di scegliere un anticoagulante appropriato in base alle analisi PBMC a valle previste.

In sintesi, un protocollo per l’isolamento di PBMC che utilizza biglie magnetiche adattabile a flussi di lavoro ad alta produttività è dettagliato per soddisfare i requisiti di scalabilità senza compromettere la vitalità cellulare. Sia il metodo manuale che quello automatizzato possono essere ottimizzati per produrre concentrazioni cellulari specifiche modificando i volumi di avviamento e di risospensione. La NSW Health Statewide Biobank è passata dall’estrazione di ~60 PBMC al mese utilizzando la tradizionale tecnica di separazione a gradiente di densità a ~300 PBMC al mese utilizzando questo metodo basato su microsfere compatibile con l’automazione. Il prossimo obiettivo degli autori è quello di utilizzare la piattaforma automatizzata per elaborare fino a 1200 PBMC al mese e confrontare ulteriormente le PBMC isolate sia con tecniche basate su biglie magnetiche (manuali e automatizzate) che con tecniche di gradiente di densità per guidare l’implementazione di questa tecnica in altri laboratori con particolare attenzione alle biobanche.