Çeşitli hücre tiplerinde nükleer cisimlerdeki dinamik değişiklikleri analiz etmek için çok yönlü bir boru hattı
Summary
Bu yöntem, insan T lenfositlerinde çeşitli nükleer organizasyon paternleri ile protein dağılımını değerlendirmek için bir immünofloresan protokolünü ve miktar tayini boru hattını tanımlar. Bu protokol, numune hazırlamadan başlayarak Fiji’de yarı otomatik analizin yürütülmesine kadar devam eden ve bir Google Colab not defteri tarafından veri işleme ile sonuçlanan adım adım rehberlik sağlar.
Abstract
Transkripsiyonel kontrol gibi çeşitli nükleer süreçler, immünofloresan tekniği ile ayırt edilebilen odaklar olarak bilinen ayrı yapılar içinde meydana gelir. Bu odakların dinamiklerini çeşitli hücresel koşullar altında mikroskopi yoluyla araştırmak, hücresel kimliği ve işlevleri yöneten moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinde immünofloresan testleri yapmak ve bu odakların montajı, difüzyonu ve dağılımındaki değişiklikleri değerlendirmek çok sayıda zorluk ortaya çıkarmaktadır. Bu zorluklar, numune hazırlama, görüntüleme verilerini analiz etmek için parametrelerin belirlenmesi ve önemli veri hacimlerinin yönetimindeki karmaşıklıkları kapsar. Ayrıca, mevcut görüntüleme iş akışları genellikle yetkin kullanıcılar için uyarlanır ve bu nedenle erişilebilirliği daha geniş bir kitleye sınırlar.
Bu çalışmada, ilgilenilen herhangi bir protein ve hücre tipi için özelleştirilebilen, farklı insan birincil T hücre tiplerinde nükleer proteinleri araştırmak için uyarlanmış optimize edilmiş bir immünofloresan protokolü sunuyoruz. Ayrıca, ister farklı odaklar oluştursunlar, ister dağınık bir nükleer dağılım sergilesinler, protein boyamayı tarafsız bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunuyoruz.
Önerilen yöntemimiz, Jython’da geliştirilen ve Fiji’de yürütülebilen yarı otomatik bir boru hattından yararlanarak, hücresel boyamadan analize kadar kapsamlı bir kılavuz sunmaktadır. Ayrıca, veri yönetimini kolaylaştırmak için bir Google Colab not defterinde herkesin erişebileceği kullanıcı dostu bir Python komut dosyası sağlıyoruz. Yaklaşımımız, farklı bağlamlarda çeşitli nükleer organizasyon modellerine sahip proteinler için son derece bilgilendirici immünofloresan analizleri sağlamada etkinlik göstermiştir.
Introduction
Ökaryotik genomun organizasyonu, nükleer cisimler veya yoğunlaşmalar2 adı verilen özel bölmelerde meydana gelebilecek çeşitli nükleer işlevleri koordine eden çok sayıda epigenetik modifikasyon 1 katmanı tarafındanyönetilir. Bu yapılar içinde transkripsiyon başlatma 3, RNA işleme 4,5,6, DNA onarımı 7,8, ribozom biyogenezi 9,10,11 ve heterokromatin regülasyonu12,13 gibi süreçler gerçekleşir. Nükleer cisimlerin düzenlenmesi, faz ayırmailkelerinin rehberliğinde hücresel gereksinimleri karşılamak için hem uzamsal hem de zamansal boyutlarda ayarlama yapar 14,15. Sonuç olarak, bu cisimler, işlevsel bileşenlerin bir araya getirildiği ve söküldüğü, boyut ve mekansal dağılımda değişikliklere uğradığı geçici fabrikalar olarak işlev görür. Bu nedenle, nükleer proteinlerin özelliklerini, cisim oluşturma eğilimleri ve farklı hücresel koşullardaki uzamsal düzenlemeleri de dahil olmak üzere mikroskopi ile anlamak, işlevsel rolleri hakkında değerli bilgiler sunar. Floresan mikroskobu, nükleer proteinleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, floresan antikorlar aracılığıyla tespit edilmelerine veya bir floresan protein raportörü16,17 ile hedefleri doğrudan ifade etmelerine izin verir.
Bu bağlamda, nükleer cisimler, kayda değer bir küresellik derecesine sahip parlak odaklar veya punkta olarak görünür ve bu da onları çevredeki ortamdan kolayca ayırt edilebilir hale getirir16,18. STORM ve PALM gibi süper çözünürlük teknikleri, gelişmiş çözünürlük (10 nm’ye kadar)19 sağlayarak, belirli kondensatların yapısının ve bileşiminin daha hassas bir şekilde karakterize edilmesini sağlar20. Bununla birlikte, erişilebilirlikleri, ekipman masrafları ve veri analizi için gereken özel becerilerle sınırlıdır. Bu nedenle, konfokal mikroskopi, çözünürlük ve daha geniş kullanım arasındaki elverişli dengesi nedeniyle popülerliğini korumaktadır. Bu popülerlik, doğru segmentasyon için kapsamlı işlem sonrası prosedürlere olan gereksinimi, araştırma enstitülerinde yaygın olarak kullanılabilirliğini, etkili edinme süresini ve tipik olarak verimli olan numune hazırlamayı azaltan odak dışı ışığın doğal olarak kaldırılmasıyla kolaylaştırılır. Bununla birlikte, çeşitli hücresel koşullar boyunca immünofloresan tahlilleri kullanılarak protein dağılımının, montajının veya difüzyonunun doğru bir şekilde ölçülmesi, mevcut birçok yöntemin değişen dağılım modellerine sahip proteinler için uygun parametrelerin seçilmesi konusunda rehberlik gerektirmemesi nedeniyle zorluklar doğurmaktadır21. Ayrıca, ortaya çıkan büyük veri hacminin ele alınması, veri analizi konusunda sınırlı deneyime sahip kullanıcılar için göz korkutucu olabilir ve sonuçların biyolojik önemini potansiyel olarak tehlikeye atabilir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, çeşitli organizasyon modelleriyle protein boyamayı ölçmek için tarafsız bir yöntem sağlamayı amaçlayan, immünofloresan hazırlama ve veri analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz (Şekil 1). Bu yarı otomatik işlem hattı, hesaplama ve görüntüleme analizinde sınırlı uzmanlığa sahip kullanıcılar için tasarlanmıştır. İki yerleşik Fiji eklentisinin işlevlerini birleştirir: FindFoci22 ve 3D suite23. FindFoci’nin kesin odak tanımlama yeteneğini, 3B paket tarafından sunulan 3B alandaki nesne tanımlama ve segmentasyon özellikleriyle entegre ederek, yaklaşımımız her bir edinme alanı için kanal başına iki CSV dosyası oluşturur. Bu dosyalar, hücre başına odak sayısı, odakların nükleer merkeze olan uzaklığı ve dağınık protein boyama için tanıttığımız homojenlik katsayısı (IC) gibi çeşitli sinyal dağılımı türlerine uygun metriklerin hesaplanmasını kolaylaştıran tamamlayıcı bilgiler içerir. Ayrıca, veri işleme becerilerine sahip kullanıcılar için veri ekstrapolasyonunun zaman alıcı olabileceğini kabul ediyoruz. Bu süreci kolaylaştırmak için, toplanan tüm ölçümleri her deneme için otomatik olarak tek bir dosyada derleyen bir Python betiği sağlıyoruz. Kullanıcılar, herhangi bir programlama dili yazılımı yüklemeye gerek kalmadan bu komut dosyasını çalıştırabilir. Python komut dosyalarının doğrudan tarayıcıda yazılmasına izin veren bulut tabanlı bir platform olan Google Colab’da yürütülebilir bir kod sağlıyoruz. Bu, yöntemimizin sezgisel olmasını ve anında kullanım için kolayca erişilebilir olmasını sağlar.
Protokolümüzün iki nükleer proteinin sinyal dağılımındaki değişiklikleri analiz etmede ve ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz: Bromodomain içeren protein 4 (BRD4) ve zeste-12’nin baskılayıcısı (SUZ12). BRD4, polimeraz II’ye bağlı transkripsiyonel başlatma24,25 ile ilişkili kondensatlar oluşturduğu bilinen Mediator kompleksi içinde iyi belgelenmiş bir koaktivatör proteindir. SUZ12, H3K27me3 histon modifikasyonu 26,27’nin birikimini düzenlemekten sorumlu Polycomb Baskılayıcı Kompleks2’nin (PRC2) bir protein bileşenidir. Bu proteinler, iki farklı hücre tipi içinde farklı desenler sergiler: hareketsiz ve yavaş transkripsiyonel aktivite oranları sergileyen taze izole edilmiş insan CD4+ naif T hücreleri ve in vitro farklılaşmış TH1 CD4 + hücreleri, artan transkripsiyon gösteren özelleşmiş, çoğalan efektör hücreler28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, insan T lenfositlerindeki nükleer proteinler üzerinde immünofloresan deneyleri yapmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, daha önce tarif edildiği gibi, fiksasyon ve geçirgenlik aşamalarında küçük değişiklikler yoluyla çeşitli hücre tipleriyle kullanım için esneklik sunar30,31.
Görüntüleme iş akışımız, özellikle FindFoci ve 3D Suite22,23<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
INGM Görüntüleme Tesisi’nin, özellikle C. Cordiglieri ve A. Fasciani’nin ve INGM FACS ayıklama tesisinin, özellikle M.C Crosti’nin (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), Milano, İtalya) bilimsel ve teknik yardımına teşekkür ederiz. M. Giannaccari’ye teknik bilişim desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle finanse edilmiştir: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, hibe nr 2018-0321) ve Fondazione AIRC (hibe nr MFAG 29165) F.M. Ricerca Finalizzata, (hibe nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (hibe nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (hibe nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (hibe nr G43C22002620007) ve Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (hibe nr 2022PKF9S) B’ye. B.
Materials
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
References
- Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
- Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
- Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225.e24 (2021).
- Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
- Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
- Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).
- Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).
- Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562 (2019).
- Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
- Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
- Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
- Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
- Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
- Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
- Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Scalisi, S., Ahmad, A., D’Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).
- Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958 (2018).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
- Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082 (2021).
- Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
- Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
- Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
- Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).
.