さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

真核生物のゲノムの組織化は、エピジェネ^{ティックな修飾}1の複数の層によって支配されており、核体または凝縮物²と呼ばれる特殊なコンパートメント内で発生する可能性のあるいくつかの核機能を調整しています。これらの構造内では、転写開始³、RNAプロセシング^4,5,6、DNA修復^7,8、リボソーム生合成^9,10,11、ヘテロクロマチン制御^12,13などのプロセスが進行します。核体の調節は、相分離^{の原理14,15}に導かれて、細胞の要件に対応するために空間的および時間的次元の両方で調整されます。その結果、これらの物体は、機能部品が組み立てられ、分解され、サイズや空間分布が変化する過渡的な工場として機能します。したがって、核タンパク質の特性(体を形成する傾向やさまざまな細胞条件での空間配置など)を顕微鏡で理解することは、その機能的役割に関する貴重な洞察を提供します。蛍光顕微鏡法は、核タンパク質を研究するために広く使用されている方法であり、蛍光抗体を介してそれらを検出したり、蛍光タンパク質レ^{ポーター16,17}で直接標的を発現させたりすることができる。

この文脈では、核体は明るい病巣またはプンクタとして現れ、顕著な程度の球形性を伴い、周囲の環境と容易に区別できる^16,18。STORMやPALMのような超解像技術は、分解能の向上(最大10nm)¹⁹を提供することにより、特定の凝縮物²⁰の構造と組成のより正確な特性評価を可能にする。しかし、その利用可能性は、設備費やデータ分析に必要な専門スキルによって制限されています。したがって、共焦点顕微鏡は、分解能と幅広い使用との間の良好なバランスにより、依然として人気があります。このような人気は、焦点が合っていない光を本質的に除去することで、正確なセグメンテーションのための広範な後処理手順の必要性が減少し、研究機関で広く利用可能になり、効果的な取得時間、および一般的に効率的なサンプル調製によって促進されます。しかし、免疫蛍光アッセイを用いて多様な細胞条件でタンパク質の分布、アセンブリ、または拡散を正確に測定することは、多くの既存の方法がさまざまな分布パターンを持つタンパク質に適したパラメータを選択するためのガイダンスを欠いているため、課題を提起します²¹。さらに、結果として生じる大量のデータを処理することは、データ分析の経験が限られているユーザーにとっては困難であり、結果の生物学的意義を損なう可能性があります。

これらの課題に対処するために、免疫蛍光法の調製とデータ解析のための詳細なステップバイステップのプロトコールを導入し、さまざまな組織パターンでタンパク質染色を偏りなく定量する方法を提供することを目指しています(図1)。この半自動パイプラインは、計算解析とイメージング解析の専門知識が限られているユーザー向けに設計されています。これは、2つの確立されたフィジープラグイン、^FindFoci22 と3Dスイート²³の機能を組み合わせたものです。FindFociの正確な病巣識別機能と、3Dスイートが提供する3D空間のオブジェクト識別およびセグメンテーション機能を統合することにより、私たちのアプローチは、取得フィールドごとにチャネルごとに2つのCSVファイルを生成します。これらのファイルには、細胞あたりの病巣数、核重心からの病巣の距離、びまん性タンパク質染色に導入した不均一性係数(IC)など、さまざまなタイプのシグナル分布に適したメトリクスの計算を容易にする補完的な情報が含まれています。さらに、データ外挿は、データ処理スキルが限られているユーザーにとって時間がかかる可能性があることを認識しています。このプロセスを効率化するために、各実験で収集されたすべての測定値を1つのファイルに自動的にコンパイルするPythonスクリプトを提供しています。ユーザーは、プログラミング言語ソフトウェアをインストールしなくても、このスクリプトを実行できます。Google Colabは、ブラウザで直接Pythonスクリプトを記述できるクラウドベースのプラットフォームであるGoogle Colabで実行可能コードを提供しています。これにより、当社の方法は直感的で、すぐに使用できるものとなっています。

私たちは、ブロモドメイン含有タンパク質4(BRD4)とゼステ-12のサプレッサー(SUZ12)の2つの核タンパク質のシグナル分布の変化を分析および定量化する上で、私たちのプロトコルの有効性を実証しています。BRD4は、ポリメラーゼII依存性転写開始^24,25に関連する凝縮物を形成することが知られているメディエーター複合体内の十分に文書化されたコアクチベータータンパク質です。SUZ12は、H3K27me3ヒストン修飾^26,27の沈着を制御する役割を担うポリコーム抑制複合体2(PRC2)のタンパク質成分である。これらのタンパク質は、2つの異なる細胞型内で異なるパターンを示します:静止状態で転写活性の速度が遅い、新たに単離されたヒトCD4⁺ナイーブT細胞と、転写の増加を示す特殊な増殖エフェクター細胞であるin vitro分化T_H1 CD4⁺細胞です²⁸。