Методы обеспечения пространственной транскриптомики костных тканей

Кость – это специализированная соединительная ткань, состоящая в основном из волокон коллагена 1 типа и неорганических солей¹. В результате кость получается невероятно прочной и жесткой, в то же время легкой и травмостойкой. Большая прочность кости обусловлена содержанием в ней минералов. Фактически, при любом заданном увеличении процентного содержания минералов жесткость увеличивается в пять^раз2. Следовательно, исследователи сталкиваются со значительными проблемами при анализе биологии костного образца с помощью гистологического среза.

Гистология недекальцинированной кости возможна, а иногда и необходима, в зависимости от типа исследования (например, для изучения микроархитектуры кости); Тем не менее, это очень сложная задача, особенно если экземпляры крупные. В этих случаях обработка тканей в гистологических целях требует нескольких модификаций стандартных протоколов и методик³. Как правило, для проведения общих гистологических оценок костные ткани декальцифицируются сразу после фиксации, что может занять от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от размера ткани и используемого декальцифицирующего агента^. Декальцинированные срезы часто используются для обследования костного мозга, диагностики опухолей и т.д. Существует три основных типа декальцинирующих агентов: сильные кислоты (например, азотная кислота, соляная кислота), слабые кислоты (например, муравьиная кислота) и хелатирующие агенты (например, этилендиаминэтрицензиновая кислота или ЭДТА)⁵. Сильные кислоты могут очень быстро декальцинировать кость, но они могут повредить ткани; слабые кислоты очень распространены и подходят для диагностических процедур; Хелатирующие агенты на сегодняшний день являются наиболее используемыми и подходящими для исследовательского применения, поскольку в этом случае процесс деминерализации является медленным и щадящим, что позволяет сохранить высококачественную морфологию и сохранить информацию о генах и белках, как того требуют многие процедуры (например, гибридизация in situ , иммуноокрашивание). Однако, когда необходимо сохранить весь транскриптом, например, для анализа экспрессии генов, даже медленная и щадящая деминерализация может быть вредной. Следовательно, необходимы более совершенные подходы и методы, когда морфологический анализ тканей должен сочетаться с анализом экспрессии генов клеток.

Благодаря недавним усовершенствованиям в секвенировании РНК одиночных клеток (scRNA-seq) и пространственной транскриптомике, теперь стало возможным изучать экспрессию генов образца ткани даже в тех случаях, когда для хранения образцов тканей использовалось парафиновложение фиксации формалина (FFPE) ^6,7,8. Эта возможность открыла доступ к большему количеству образцов, например, хранящихся в банках тканей по всему миру. Если необходимо использовать scRNA-seq, наиболее важным требованием является целостность РНК; однако в случае пространственной транскриптомики образцов FFPE для визуализации экспрессии гена в гистологическом контексте каждого среза ткани необходимы как высококачественные срезы ткани, так и высококачественные РНК. В то время как это было легко достигнуто с помощью мягких тканей, этого нельзя сказать о твердых тканях, таких как кости. На самом деле, насколько нам известно, ни одно исследование с использованием пространственной транскриптомики никогда не проводилось на образцах костей FFPE. Это связано с отсутствием протоколов, которые могли бы эффективно обрабатывать костные ткани FFPE с сохранением содержания в них РНК. В этом случае сначала предлагается метод обработки и декальцинации свежеполученных образцов костной ткани, избегая деградации РНК. Затем, признавая необходимость транскриптомного анализа образцов FFPE, собранных в банках тканей по всему миру, также представлены разработанные рекомендации по надлежащему обращению с образцами FFPE недеминерализованных костей.