חיסון והתבוננות בתרביות מיקוריזה ארבוסקולריות על מערכות אוטוטרופיות מבוססות פולימרים סופר-סופגים
Summary
במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה וזולה לחיסון והתבוננות בפטריות מיקוריזה ארבוסקולריות במערכות אוטוטרופיות סופר-סופגות מבוססות פולימרים.
Abstract
פטריות מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) קשות למניפולציה וצפייה בשל הקשר הקבוע שלהן עם שורשי צמחים והתפשטות בריזוספרה. בדרך כלל, פטריות AM מתורבתות בתנאי in vivo בתרבית מריחואנה עם פונדקאי אוטוטרופי או בתנאי מבחנה עם שורשים מותמרים של Ri Transfer-DNA (פונדקאי הטרוטרופי) בצלחת פטרי. בנוסף, גידול פטריות AM בתרבית מריחואנה מתרחש בסביבה אטומה ולא סטרילית. לעומת זאת, תרבית חוץ גופית כרוכה בריבוי פטריות AM בסביבה סטרילית ושקופה. המערכת האוטוטרופית הסופר-סופגת המבוססת על פולימרים (SAP-AS) פותחה לאחרונה והוכחה כמשלבת את היתרונות של שתי השיטות תוך הימנעות ממגבלותיהן בהתאמה (אטימות ומארח הטרוטרופי, סטריליות). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנה קלה, חיסון נבג בודד ותצפית על פטריות AM ב- SAP-AS. על ידי שינוי צלחות הפטרי, תצפיות צילום ווידיאו ברזולוציה גבוהה היו אפשריות על דגימות חיות, דבר שהיה קשה או בלתי אפשרי עם טכניקות זרם in vivo ו – in vitro .
Introduction
פטריות מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) (Glomeromycotina) הן סימביוטים עתיקים של שורשי צמחים (~ 500 Ma 1,2) שייתכן שמילאו תפקיד חיוני בהתיישבות קרקעות יבשתיות על ידי טרכאופיטים. קו-אבולוציה ארוכה זו בין פטריות AM וטרכאופיטים מציבה את מיקוריזה ארבוסקולרית כיצירת מופת של הדדיות בין-ממלכתית. קורים פטרייתיים AM מגדילים באופן משמעותי את יכולתו של הפונדקאי לחפש חומרי מזון לאדמה3, כולל העברת חומרי מזון לפונדקאים חדשים דרך רשתות מיקוריזה4. הרשת ההיפאלית משפרת את מבנה הקרקע, וייצור גלומלין יכול להפחית את סחף הקרקע5. העברת חלק מהפחמן האטמוספרי לסימביונט השורש הפטרייתי מגבירה את קיבוע הפחמן בקרקע6. באופן כללי, פטריות AM משפרות את עמידות הצמחים הן לעקה אביוטית והן לעקה ביוטית ולכן זכו לתשומת לב רבה באגרואקולוגיה7. ואכן, לשיטות ניהול חקלאיות ידידותיות לפטריות AM יש פוטנציאל להפחית את השימוש בתשומות כימיות לייצור יבולים ולשפר את תכולת הפחמן האורגני בקרקע, שהן מטרות חשובות שחקלאים צריכים לשלב בפרקטיקות הניהול שלהם על מנת לעמוד בהתחייבויות לאומיות ובינלאומיות בנוגע למעבר לפרקטיקות חקלאיות בנות קיימא והמאבק בשינויי האקלים.
עם זאת, פטריות AM הן פטריות מיקרוסקופיות קרקע, והמחקר שלהן קשה בשל הביוטרופיה המחייבת שלהן ופיזור הריזוספרה. קרקע היא אחד הביוטופים הקשים ביותר לחקר בגלל האטימות שלה, המגוון העצום של נישות, ואינטראקציות רב-טרופיות בכל קנה מידה. הבידוד, ההתרבות והאפיון של פטריות AM הם אפוא קשים. עד אמצע המאהה-20 אופיינו רק מיני פטריות AM היוצרים ספורוקרפים 8. עם זאת, רוב מיני פטריות AM מייצרים נבגים שאינם ספורוקרפיים בקוטר של ~20 מיקרומטר עד ~500 מיקרומטר. תיאור טכניקת הניפוי הרטוב בקרקע9 פתח את הדרך לתיאור מיני פטריות אלה, וקצב תיאור המינים גדל מאז. עם זאת, פטריות AM מייצגות קבוצה קטנה של מינים בהשוואה לדיקריה.
תרביות מלכודת, כלומר חיסון בנבגים או דגימת קרקע סביבתית המכילה נבגי פטריית AM של עציץ מלא בחומר אוטוקלאבי כגון טורפני וורמיקוליט וזרע מעוקר של פונדקאי (כרישה, פלנטיין), היא אחת הדרכים להפיץ פטריות AM בתנאים מבוקרים10. עם זאת, את הצלחת החיסון ניתן להעריך רק על ידי חיפוש נוכחות של arbuscules בשברי שורש לאחר צביעה או על ידי מסננת רטובה של תת דגימה או את הסיר כולו כדי לבודד נבגים. בדרך כלל מומלץ לא להפריע למערכת לפחות 6-12 שבועות לפני ניתוח תרבית הסיר. טכניקת תרבית זו מתאימה לריבוי רוב מיני הפטריות הידועים, אך תצפית חיה בסימביונט הפטרייתי אינה אפשרית, והצלחת החיסון אינה ודאית, במיוחד כאשר מנסים תרביות נבגים בודדים.
להיפך, ניתן לנטר את ההתפשטות במבחנה של פטריות AM בשידור חי הודות לשקיפות של מדיום התרבות11, אך טכניקת תרבית זו דורשת זמינות של שורשים מותמרים ונוכחות של פחמן במדיום התרבית כדי לעבוד בסביבה סטרילית. יש לעקר את הנבגים, ויחד עם הקשר עם פונדקאי הטרוטרופי, רוב מיני פטריות AM הידועים אינם מופצים בהצלחה בטכניקה זו.
לכן, התפשטות של פטריות AM באמצעות טכניקות הנוכחיות, אם כי הוקמה בשימוש נרחב ברוב המעבדות, יש כמה מגבלות לחקר פטריות AM. Paré et al. (2022)12 פיתחו טכניקת in vivo באמצעות פולימר סופר-סופג שקוף (SAP) בשילוב עם צמחים שלמים להפצת פטריות AM. הטכניקה, שתוכננה כמערכת אוטוטרופית מבוססת SAP (SAP-AS), פשוטה וזולה ומשלבת את היתרונות של תרבית הגראס (שיוך לפונדקאי אוטוטרופי, תנאים לא סטריליים) ותרביות חוץ גופיות (מדיום שקוף, ניטור חי של התפתחות סימביוזה). כאן, אנו מציגים פרוטוקול המסביר כיצד להגדיר את התרביות עם חיסון נבג יחיד ולהשתמש ב- SAP-AS לתצפית בהגדלה גבוהה של התפטיר החוץ-רדיקלי. באופן ספציפי, אנו מתארים כיצד לשנות צלחות פטרי דו-תאיות, להכין את התמיסה המזינה, להכין את הפולימר הסופג במיוחד (SAP), להכין את השתילים, להרכיב את SAP-AS ולחסן בנבג יחיד, להנביט את הנבגים, ולעקוב באופן חי אחר התפתחות הסימביוזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
החיסון הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול, ופיפטות פסטר מזכוכית מושחלת הוכיחו את עצמן ככלי מצוין למניפולציה מדויקת של נבגים בודדים של פטריות AM תוך שמירה על שלמותן. פיפטות פסטר מזכוכית מושחלת מעוצבות בקלות באמצעות להבה של נר או מבער בונזן, וניתן לכוונן את הפתח תחת הסטריאומיקרוסקופ כך שיתאים לגודל הנבג המועבר. חשוב לתפעל את הנבגים בעזרת כלים המותאמים לגודל הנבג הפטרייתי AM (איור משלים 1) ולחסן את SAP-AS כאשר שורשי הצמח הפונדקאי ארוכים מספיק כדי להגיע לקרום הניטקס שבו הנבג שוקע.
קל להתאים את SAP-AS לדרישות הניסוי. ניתן להשתמש בצלחות פטרי גדולות יותר, עם תאים מרובים, כדי לנטר, למשל, את האינטראקציה בין זנים קרובים או בין מינים שונים של AMF או לשנות את הסביבה הכימית (pH) או הביולוגית (הכנסת נמטודות, חיידקים, פטריות). צמחים פונדקאים מיקוטרופיים שונים יכולים לשמש גם כדי לספק לפטריות AM פוטוסינתטים. התמיסה התזונתית mMS-1 נגזרה מהמתכון הבינוני המינימלי (M) שתואר על ידי Bécard and Fortin (1988)15 פחות סוכרוז, ויטמינים ואגר בקטו כדי להגביל מקורות פחמן. עם זאת, ניתן להשלים את SAP-AS עם פתרונות תזונתיים שונים, בהתאם למטרות הניסוי.
התפשטות פטריות AM ב-SAP-AS דורשת השקיה קבועה. הנפח המוגבל של ורמיקוליט ו-SAP חושף את השורשים ואת פטריית AM לתנודות בלחות, במיוחד בצלחות פטרי סטנדרטיות בעלות שני תאים (קוטר 10 ס”מ). היכולת להתרחב, ולכן, את השקיפות של גרגרי SAP פוחתת עם הזמן. למעשה, נוכחות קטיונים מתמיסת החומרים המזינים מגבילה בהדרגה את הרחבת רשת האקרילט ומחייבת החלפת SAP לאחר חודשים. בנוסף, אצות ירוקות ועובש עשויים לגדול עם הזמן אם צלחות פטרי אינן מוגנות כראוי מפני אור או השקיית יתר.
עד כה, שבעה מינים של פטריות AM טופחו בהצלחה ב-SAP-AS, שזה הרבה מתחת למספר מיני פטריות AM שניתן להפיץ בתרביות עציצים. עם זאת, הן התנאים הביוטיים והן התנאים הא-ביוטיים ב-SAP-AS דומים מאוד לאלה שבתרביות מריחואנה, וסביר להניח שמינים אחרים של פטריות AM אמורים להיות מסוגלים להתרבות ב-SAP-AS. חיסון ישיר של נבגים ב-SAP-AS מספק ככל הנראה תנאים סביבתיים קרובים יותר לאלה של הריזוספרה בקרקע טבעית בשל נוכחות של הפרשות שורשים ו/או חיידקים, אם משתמשים בנבגים/זרעים לא סטריליים לחיסון. יש להעדיף זאת על פני חיסון בנבגים מונבטים. בנוסף, התנאים המפעילים נביטת נבגים בתוך AMF עדיין אינם מובנים היטב, ולכן SAP hydrated עם תמיסת מזין mMS-1 לא יכול להיות מותאם לנבוט נבגים של מינים אחרים של פטריות AM. נביטת נבגים ב-SAP עם תמיסת mMS-1 נבדקה כדי לבחור באופן ספציפי נבגים בני קיימא לשלב החיסון באמצעות חיסון R. irregularis בלבד.
חיסון ומעקב אחר התפתחות סימביוזה AM מבוצעים בקלות ב- SAP-AS. צלחות הפטרי הדו-תאי המותאמות מאפשרות טיפוח של מינים שונים של פטריות AM. Paré et al.12 הפיצו שבעה מיני AMF שונים משישה סוגים ושלוש משפחות. שינוי של שני תאים צלחות פטרי נעשה בקלות עם כלים זולים. העלות והכמות של חומרים (ורמיקוליט, SAP, פיפטת פסטר וכו’) וריאגנטים (mMS-1) הדרושים להכנת ותחזוקת SAP-AS מוגבלים, ומאפשרים ניהול של מספר רב של SAP-AS בעלות מינימלית. היכולת לערום את SAP-AS גם מפחיתה באופן משמעותי את טביעת הרגל של תרביות פטרייתיות AM בהשוואה לתרביות מריחואנה. לדוגמה, 50 SAP-AS (5 ערימות של עשר) יכולות להתאים על מדף באורך 1 מטר (איור משלים 2). תכונות אלה הופכות את SAP-AS לטכניקה פשוטה וזולה התואמת להוראת סימביוזה AM בקורסי מעבדה בתיכון או ברמת התואר הראשון באוניברסיטאות. ניתן להשתמש בדגנים מקולחים של SAP כדי לחסן תרביות SAP-AS או מריחואנה חדשות.
נוכחותו של כיסוי בחלק האחורי של תחתית צלחת הפטרי מאפשרת צילום ברזולוציה גבוהה ווידאו של מבנים פטרייתיים אקסטרה-רדיקליים. ניתן לחקור בקלות את הזרימה הציטופלזמית בתנאי חיים הקרובים מאוד לתנאים טבעיים. יש לכך חשיבות רבה למחקרים על תפקודי פטריות AM הקשורות לתפטיר שלהן (חומרים מזינים, הובלת מים, מבנה הקרקע וכו’) ולמחקרים על מורפוגנזה היפאלית.
AMF משלימים את המחזור הביולוגי שלהם בשורשי צמחים ובתוך הריזוספרה. המחקר של מיקרואורגניזמים הקרקע הוא מורכב בשל הקושי המובנה של התבוננות בסביבת הקרקע. המטרה העיקרית של SAP-AS היא ליצור מחדש סביבה דומה ככל האפשר לריזוספרה לצורך התפשטות פטריות AM תוך שמירה על היכולת לצפות בהתפתחות פטריות AM בפירוט רב. מכיוון שזה מרמז על תנאים לא סטריליים, כמות הפחמן הזמין צריכה להיות מוגבלת כדי למנוע התפשטות של מיקרואורגניזמים סאפרוטרופיים. הידע על התנהגותן של פטריות AM בריזוספרה עדיין מוגבל ביותר, וה-SAP-AS מציע את האפשרות לערוך השוואות מפורטות בין מינים בנוגע ליכולתם לחפש מזון בסביבה חוץ-רדיקלית, ייצור הנבגים שלהם והתיישבות השורשים שלהם. זה יכול להיות מסובך עוד יותר על ידי הוספת אינטראקציות עם מיני קרקע אחרים כגון חיידקים, נמטודות, פרוטיסטים ופתוגנים פטרייתיים שורש, ואת הידע של אינטראקציות מיקרוביוטה הקרקע ניתן לשפר הודות SAP-AS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לשני הסוקרים האנונימיים על הצעותיהם. המימון למחקר זה ניתן על ידי Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) במסגרת פרויקט J-002295 (ניהול ושיפור האוספים הביולוגיים של AAFC).
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Bi-Plate | Kord Valmark | 1204U09 | https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate |
| 12-well plate | Greiner Bio-one | 665180 | https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html |
| 18 mm round glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100 |
| 20 mL Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z683620-100EA | https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=20674735406 &utm_content=157607444391&gc lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11 vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1 -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B oL7saAmFoEALw_wcB |
| Acupuncture needle | Lierre | A143-LP1-3075 | https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad _source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4 g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB& utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_ 5213169090694_35001500991622 &utm_medium=cpc&utm_source= google&variant=35001500991622 |
| Blotting paper | FLINN | FB0678 | https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/ |
| Commercial or scientific blender or kitchen hand blender | kitchenaid | KHBV53DG | https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html |
| Dremel 199 Carving Bit | Dremel | 2615000199 | https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199 |
| Dry SAP medium granulometry 1–2 mm | HORTA-SORB MD | 00810085242789 | https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/ |
| Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles | Fisher Scientific | 08-916-5B | https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b |
| Glass Pasteur pipettes 230 mm | Kimble | RK-25554-14 | https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414 |
| Ink | Sheaffer | 94321 | https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU |
| Melting guide: modified paint Scraper, 2-in | Mastercraft | #049-7335-8 | https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp |
| Microscopy glass slide | Fisher Scientific | 12-552-5 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525 |
| Nitex nylon mesh filter screen | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX30-108 | https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r& variant=6945749106731 |
| Paper clip | Makanu | Clips-BK-41mm-24 | https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes |
| Parafilm | Avantor/vwr | 470201-930 | https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm |
| Plantago lanceolata seeds | ecoumene | NA | https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/ |
| Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). | NA | NA | https://invam.ku.edu/recipes |
| Pyrography kit with fine tip | Walnut Hollow | 483103 | https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool |
| Silicone sealant | Aqueon | 100165003 | https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant |
| Surgeon scalpel handle | Fisher Scientific | 22-079657 | https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel |
| Two Speed Rotary Tool Kit | Dremel | 200-1/21 | https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah |
| Vermiculite | PRO-MIX | 4981110 | https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html |
| X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) | Fisher Scientific | 12164692 | https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692 |
References
- Dotzler, N., Krings, M., Taylor, T. N., Agerer, R. Germination shields in Scutellospora (Glomeromycota: Diversisporales, Gigasporaceae) from the 400 million-year-old Rhynie chert. Mycol Prog. 5 (3), 178-184 (2006).
- Redecker, D. Glomalean fungi from the ordovician. Science. 289 (5486), 1920-1921 (2000).
- Olsson, P. A., Jakobsen, I., Wallander, H. . Foraging and Resource Allocation Strategies of Mycorrhizal Fungi in a Patchy Environment. Mycorrhizal Ecology. Ecological Studies. , (2003).
- Zheng, C., Chai, M., Jiang, S., Zhang, S., Christie, P., Zhang, J. Foraging capability of extraradical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi to soil phosphorus patches and evidence of carry-over effect on new host plant. Plant Soil. 387 (1-2), 201-217 (2015).
- Singh, A. K., et al. The role of glomalin in mitigation of multiple soil degradation problems. Crit Rev Environ Sci Technol. 52 (9), 1604-1638 (2022).
- Wilson, G. W. T., Rice, C. W., Rillig, M. C., Springer, A., Hartnett, D. C. Soil aggregation and carbon sequestration are tightly correlated with the abundance of arbuscular mycorrhizal fungi: results from long-term field experiments. Ecol Lett. 12 (5), 452-461 (2009).
- Gianinazzi, S., Gollotte, A., Binet, M. -. N., van Tuinen, D., Redecker, D., Wipf, D. Agroecology: the key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Stürmer, S. L. A history of the taxonomy and systematics of arbuscular mycorrhizal fungi belonging to the phylum Glomeromycota. Mycorrhiza. 22 (4), 247-258 (2012).
- Gerdemann, J. W., Nicolson, T. H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Trans Br Mycol Soc. 46 (2), 235-244 (1963).
- Walker, C., Vestberg, M. A simple and inexpensive method for producing and maintaining closed pot cultures of arbuscular mycorrhizal fungi. Agr Sci Finland. 3, 233-240 (1994).
- Fortin, J. A., et al. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J Bot. 80 (1), 1-20 (2002).
- Paré, L., Banchini, C., Hamel, C., Bernier, L., Stefani, F. A simple and low-cost technique to initiate single-spore cultures of arbuscular mycorrhizal fungi using a superabsorbent polymer. Symbiosis. 88, 61-73 (2022).
- Saha, A., Sekharan, S., Manna, U. Superabsorbent hydrogel (SAH) as a soil amendment for drought management: A review. Soil Tillage Res. 204, 104736 (2020).
- Bécard, G., Fortin, J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. 108 (2), 211-218 (1988).
- Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piché, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).
