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신경과학

쥐에서 편측 경추 척수 반절개 후 완충 횡격막 활동의 기능적 회복 평가

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66828
, , , ,
1Department of Physiology and Biomedical Engineering,Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine,Mayo Clinic

Summary

호흡기 합병증은 경추 척수 손상(cSCI)이 있는 개인의 주요 사망 원인입니다. cSCI의 동물 모델은 기계론적 평가 및 전임상 연구에 필수적입니다. 여기에서는 쥐에서 편측 C2 척추 반절 (C2SH) 후 횡격막 근육 (DIAm) 활동의 기능적 회복을 평가하는 재현 가능한 방법을 소개합니다.

Abstract

cSCI 후 DIAm의 활성화는 부상 정도에 따라 영향을 받을 수 있습니다. 본 논문은 쥐에서 호흡하는 동안 완곡성 동측 횡격막(iDIAm) 근전도(EMG) 활동을 방해하는 cSCI의 일방적C2 반절개(C2SH) 모델을 설명합니다. DIAm 모터 제어의 회복을 평가하려면 먼저C2SH로 인한 적자 정도를 명확하게 설정해야 합니다. 호흡 중 iDIAm EMG의 완전한 초기 손실을 확인함으로써 후속 회복은 부재 또는 존재로 분류할 수 있으며 EMG 진폭을 사용하여 회복 정도를 추정할 수 있습니다. 또한,C2SH후 급성 척추 쇼크 기간 후 호흡 중 iDIAm EMG 활성이 지속적으로 부재하는 것을 측정함으로써 초기C2SH의 성공을 검증할 수 있습니다. 반대측 횡격막(cDIAm) EMG 활성을 측정하면 신경 가소성을 반영하는 C2SH의 보상 효과에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 더욱이, 깨어 있는 동물의 DIAm EMG 기록은 C2SH 이후 DIAm의 운동 제어에 대한 중요한 생리학적 정보를 제공할 수 있습니다. 이 기사에서는 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C2SH 모델을 위한 방법을 설명하며, 이는 호흡 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

Introduction

미국에는 300,000명 이상의 척수 손상(SCI) 환자가 있으며, 그 중 약 절반이 경추 손상을 가지고 있습니다1. 이러한 부상은 심각한 웰빙 손실을 초래하고 개인, 가족 및 의료 시스템에 재정적 부담을 줍니다. 다행히도 대부분의 SCI는 불완전하여 예비 경로를 강화할 수 있는 잠재력을 제공합니다1. 이러한 신경가소성은 인공호흡 및 비인공호흡 행동에 중요한 DIAm 활동을 포함한 적어도 일부 기능의 회복을 허용할 수 있습니다. 따라서 신경 가소성을 촉진하는 것은 SCI2 환자를 돕기 위한 유망한 연구 방법입니다.

SCI의 설치류 모델은 인간의 건강을 개선하기 위한 치료법의 발견에 실질적으로 기여할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 신경 가소성을 연구하는 데 사용되는 SCI의 고전적인 모델 중 하나는 C2 (C2SH)에서 척수의 편측 횡단 (반절개)으로, 반대쪽은 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13을 그대로 유지합니다. 횡격막 출력에 대한 C2SH의 효과와 보존된 반대측 경로의 중요성은 100여 년 전 Porter12에 의해 처음 밝혀졌으며, 그의 중요한 논문은 호흡 신경 가소성에 대한 현대 연구의 토대를 마련했습니다. C2SH모델은 호흡 리듬 생성14의 출력을 전달하는 전운동 뉴런을 포함하는 수질의 rVRG(rostral ventral respiratory group)로부터의 하강 입력을 중단한다. 이러한 rVRG 전운동 뉴런은 또한 흥분성 신경 드라이브를 횡격막 운동 뉴런으로 전달합니다(그림 1). 여러 연구자들이 C2SH 모델10,11,15,16에 대해 다른 접근 방식을 취했으며, 이는 연구 간 회복의 변동성 중 일부를 부분적으로 설명할 수 있습니다. 간단히 말해서, 접근 방식은 등쪽 funiculi를 보존하거나, 완전한 반절개를 수행하거나, 동측 rVRG의 하강 입력을 완전히 중단하지 않는 측면 부분 횡단을 수행하는 측면에서 다양합니다. 일반적으로,C2SH모델은 시간이 지남에 따라 완납 iDIAm 근전도(EMG) 활성의 자발적 회복 속도 때문에 호흡기 신경가소성을 연구하는 데 특히 유용하며, 이는 신경영양성 신호전달을 포함한 여러 요인에 의해 개선될 수 있다 17,18,19,20,21. 그러나 완곡한 iDIAm EMG 활동의 침묵으로 정의되는 초기 기능 상실은 회복을 명확하게 분류하기 전에 먼저 확립되어야 합니다. C2SH시점에서의 비활성에 대한 이러한 검증은 여러 연구 3,4,6,7,11,22,23에서 수행되지 않는다.

절제된 척수의 조직학적 평가는 척수의 횡격막 운동 뉴런을 자극하는 동측 흥분성 구근 경로의 적절한 위치에 대한 손상의 증거만 제공하지만, 조직학은 생리학적 증거(예: DIAm EMG)를 대체하지 않습니다. 또한, 조직학적 평가는 최종 시점(종종 부상 후 몇 주에서 몇 달)에 생체 외에서 수행되며 “실시간” 정보를 제공하지 않습니다. 일부 연구자들은 병변의 크기가 기능적 결함 또는 그 결핍의 양과 관련이 있다고 지적했다 5,24,25,26. 이러한 주장의 타당성은 “기능”을 분류하는 방법(즉, 기능적 작업이 무엇이며 어떻게 정량화되는지)에 따라 크게 달라질 수 있으며, 연구 간의 차이는 동물 간에 기능적으로 동일한 병변을 생성하는 것이 어렵다는 점을 강조한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 실제로, 연구자들은 부상 정도와 사지 근육 운동 기능 사이의 관계(Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB) 점수24로 정량화됨)가 선형이 아니라는 점을 강조했습니다27,28. 이전 연구에서는C2SH의 정도와 손상 후 완청색 iDIAm EMG 활동의 회복 정도 사이에 관계가 없음을 발견했지만10,29,30,31 다른 연구자들은 환기 기능과 백질 보존 정도 사이의 관계를 보고했습니다 5. 따라서,C2SH모델의 경우, 수술 시점 및 바람직하게는 만성 척수 손상 실험의 시간 경과 초기에 iDIAm 비활성의 기능적 검증을 위한 접근법이 유익하고 필요하다.

본 논문은 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가뿐만 아니라 C2SH 후 호흡 중 DIAm EMG의 초기 손실을 실시간으로 확인하고 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가를 위해 DIAm EMG를 사용하는 것을 강조합니다 18,21,31,32,33. C2SH 모델을 사용한 초기 연구에서는 DIAm EMG 10,13,30,34를 기록하기 위해 반복적인 개복술을 수행했습니다. 그러나 보다 최근의 연구는 만성 근전도 전극을 사용하여 마취되고 깨어 있는 쥐에서 근전도를 기록할 수 있습니다. 또한 만성 전극은 기흉의 위험을 줄이고 DIAm35,36의 억제를 유발할 수 있는 반복적인 개복술이 필요하지 않습니다. 많은 연구자들이C2SH모델의 버전을 사용했지만, 수술 당시에는 iDIAm 활성의 침묵에 대한 확인이 이루어지지 않았다 3,4,6,7,11,22,23. 이러한 비활성에 대한 확인이 없으면 후속 회복의 어느 부분이 동측 경로와 반대측 경로의 신경 가소성에 기인하는지 알기 어려우며, 이는 차별적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 rVRG에서 횡격막 운동 뉴런으로의 흡기 신경 드라이브가 주로 동측성이기 때문에 중요한 고려 사항이며, C2SH33 이후 횡막 운동 뉴런에 대한 흥분성 글루타마테르 입력의 약 50%가 손실됩니다. 그러나 반대측 rVRG에서 병변 부위 아래로 감소하여 동측 횡격막 운동 뉴런을 자극하고 신경 가소성을 통해 강화하여 기능 회복을 촉진할 수 있는 흡기 흥분성 입력이 남아 있습니다. 횡격막 운동 뉴런에 대한 우세한 동측 흥분성 입력을 제거함으로써, 완납 iDIAm EMG 활성은 (적어도 마취 하에서) 손실되는 반면, cDIAm의 활성은 계속되고 심지어 향상됩니다. 따라서 호흡 중 iDIAm EMG 활동의 손실은 성공적인 C2SH의 척도입니다 (그림 2).

일부 수준의 iDIAm EMG 활동은 깨어 있는 동물에서 C2SH 후 1-4일 이내에 존재합니다23,37. 또한, decerebrate 동물에서, iDIAm 활성은 상부 경추 반절제 후 몇 분 내지 몇 시간 내에 존재하며, 마취에 의해 억제된다38. 또한, C2SH의 성공은 부상 후 3일째에 마취된 쥐에서 호흡(유프니아) 중 iDIAm EMG 활성이 없음을 확인함으로써 검증됩니다. 공초점 이미징 연구는 이 손상의 초기 단계에서 횡격막 운동 뉴런의 글루타마테르직 시냅스 입력의 손실을 확인했다37. 부상 후 3일째에 잔류 완청성 iDIAm EMG 활동이 있는 경우 이는 rVRG에서 동측 하강 흡기 드라이브가 불완전하게 제거되었다는 증거로 해석됩니다. 본 논문은 (1) 만성 DIAm EMG 기록, (2) C2SH 및 (3) 깨어 있는 동물 및 마취된 동물에서의 EMG 데이터 수집의 세 섹션으로 나뉩니다. 이 프로토콜은 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C2SH 모델을 설명하며, 이는 호흡기 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

Protocol

이 프로토콜은 Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: A00003105-17-R23)의 승인을 받았습니다. 본 연구의 동물은 생후 약 3개월이고 체중이 200g에서 350g 사이인 수컷과 암컷 Sprague-Dawley 쥐의 혼합이었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다. 1. 전극 이식 전극 준비언급된 장비를 사?…

Representative Results

이 기사에서 제시된 접근 방식은 C2SH의 랫 모델에서 DIAm EMG를 평가하기 위한 명확한 기준을 설정하여 작업자 간 변동성을 최소화합니다. 첫째, 그림 2와 같이C2SH직후 완곡한 iDIAm EMG 활성의 중단을 관찰해야 합니다. 그렇지 않은 경우 eupneic iDIAm 활성이 사라질 때까지 2차 횡단을 수행할 수 있습니다. 둘째,C-2SH 후 3일째에 동물을 마취하는 동안 완곡한 iD…

Discussion

C2 척추 반절개
이 기사에서 설명하는 절차는 등쪽 funiculi를 보존하면서 lateral and ventral funiculi를 가로지르는 C2 척추 병변의 검증 역할을 하는 DIAm EMG 활성의 평가를 강조합니다(그림 2A). 제안된 수술 접근법에는 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 쥐의 보행 기능을 보존하는 등쪽 funiculi를 보존하면서 횡격막 운동 뉴런에 대한 동측 입력을 여?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 NIH 자금 출처(NIH R01HL146114)를 인정합니다.

Materials

25 G Needle Cardinal Health 1188825100 Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided Ethicon J774D 3-0 Suture
Adson-Brown Forceps Fine Science Tools 11627-12 Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style Cage Braintree Scientific POR-530 Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP Shielded Biopac Systems, Inc LEAD110S Shielded lead wires for EMG
Data Acquisition Software LabChart LabChart 7.3.8 Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software – Matlab 2023b Mathworks, Inc. Version 23.2 General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting Knife Fine Science Tools 10056-12 Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11293-00 Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram Amplifier Biopac Systems, Inc EMG100C EMG amplifier
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply Module Biopac Systems, Inc IPS100C Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly Hemostats Fine Science Tools 13019-14 Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife Curette V. Mueller VM101-4414 Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting Scissors Biomedical Research Instruments, Inc. 11-2420 Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wire Cooner Wire, Inc. AS 631 AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35 ADInstruments PL3508 Data acquisition system
Scalpel Blade #11 Fine Science Tools 10011-00 Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley Rat Inotiv Order code: 002 Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical Microscope Olympus SZ61 Surgical microscope 
Suture Cutting Scissors George Tiemann & Co. 110-1250SB Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner Retractor Codman 50-5647 Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"
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Khurram, O. U., Fogarty, M. J., Zhan, W., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Assessing Functional Recovery of Eupneic Diaphragm Activity Following Unilateral Cervical Spinal Cord Hemisection in Rats. J. Vis. Exp. (208), e66828, doi:10.3791/66828 (2024).
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