Gemodificeerde Langendorff-perfusie voor verlengde perfusietijden van harttransplantaten van knaagdieren

Deze studie wordt uitgevoerd in navolging van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Massachusetts General Hospital. 1. Systeem ontwerp Monteer het systeem met de drie dubbelwandige componenten, waaronder een bellenvanger, een reservoir, een oxygenator, een peristaltische pomp en een watercirculatiepomp. Bevestig alle dubbelwandige componenten aan één clamp standaard. Verbind de componenten achtereenvolgens met siliconenslangen in twee verschillende volgordes (Figuur 1A).Sequentie 1 – Stromingspatroon van water door de mantel (ononderbroken lijnen in figuur 1A):Sluit de uitstroom van de watercirculatiepomp aan op de bodeminlaat van de bellenopvangmantel met behulp van 36 G-slangen. Dit garandeert dat het perfusaat op de juiste temperatuur (37 °C) wordt gehouden voordat het het hart bereikt, omdat het water warmte verliest terwijl het door de andere componenten van het systeem reist. Sluit de bovenste inlaat van de bellenvangmantel aan op de onderste inlaat van de reservoirmantel met behulp van slangen van dezelfde maat. Sluit vervolgens de bovenste inlaat van de reservoirmantel aan op de onderste inlaat van de oxygenatormantel. Sluit ten slotte de bovenste inlaat van de oxygenator aan op de instroom van de watercirculatiepomp. Sequentie 2 – Stromingspatroon van het perfusaat door het systeem (stippellijnen in figuur 1A)Bevestig de luer-connectoren aan beide zijden van de 16 G-slang. Bevestig het eerste uiteinde aan de bodem van het reservoir en voer het door de peristaltische pompkop. Sluit het andere uiteinde aan op een van de inlaten van de siliconenspoel in de oxygenator. Sluit een tweede stuk 16 G-slang, voorzien van luer-lock-connectoren aan beide uiteinden, bij de tweede inlaat van de siliconenspoel van de oxygenator aan op de inlaat in de bellenvanger met het lange uitsteeksel. Sluit een korter stuk 16 G-slang, voorzien van luer-connectoren, aan op de ongebruikte uitlaat van de bellenvanger op een drieweg luer-lock-klep. Verbind aan de andere kant van de driewegklep een stuk slang van 16 G met een tweede luer-klep aan het andere uiteinde. Deze tweede klep ligt direct boven het reservoir. Sluit de andere kant van het ventiel aan op meer 16 G-slangen, gevolgd door de druksensor. Sluit een buis met een kleinere diameter ( ̃3,7 mm) aan op de verticale poort van de driewegklep met een connector op de canule (14 G angiocath). Het perfusaat stroomt van het reservoir naar de oxygenator door de bellenvanger voordat het via de aortacanuleverbinding terug in het reservoir circuleert. 2. Bereiding van perfusaat Bereid basisperfusaat, 0,96% Krebs-Henseleit Buffer, 9,915 mM Dextran, 25 mM Natriumbicarbonaat, 1,054 mM Bovine Serum Albumine, 1% Pen-streptokokken, 0,13% insuline, 0,02% Hydrocortison, 0,5% Heparine en 2,75 mM calciumchloride en breng op volume met gedestilleerd water. 3. Instelling van het perfusiesysteem Sluit twee spuiten van 10 ml aan op de ventilatieopeningen aan de boven- en zijkant van de bellenvanger. Voeg het basisperfusaat (75 ml) toe aan het reservoir. Zet de slangenpomp aan en stel de watercirculatiepomp in op 37 °C. Sluit een zuurstofleiding (95% O2 en 5% CO2) aan op de derde inlaat in de oxygenator en oxygeneer het perfusaat tot een minimum pO2 van 400 mmHg. Bevestig een injectiepoort aan de verticale poort van de driewegklep direct voorbij de bellenvanger. Sluit een gevleugelde infuusnaald met een spuit van 1 ml aan op de injectiepoort (gebruikt voor bemonstering). Tik zachtjes op de injectiepoort of zuig perfusaat op met de spuit van 1 ml om eventuele luchtbellen die in het circuit zijn gekomen te verwijderen. Zodra het basisperfusaat op temperatuur en zuurstofniveau is, voert u een eerste meting van de biochemische parameters uit om de juiste ionenconcentratie (tabel 1) en de juiste oxygenatie te garanderen.OPMERKING: De ionen- en pH-waarden moeten worden afgelezen nadat de oplossing op temperatuur is gebracht (37 °C) en is geoxygeneerd met het juiste gasmengsel (95% O2, 5% CO2). Zet de druksensor op nul door de aangesloten buis los te klemmen en laat de perfusaatstroom door de open sensor en de canule in evenwicht komen. Eenmaal in evenwicht, drukt u op de nulknop in de sensorbox en klemt u de slang opnieuw vast. Registreer de basisdruk voordat het hart aan het systeem wordt gehecht voor stromen van 1 ml/min tot 15 ml/min. Lage druk perfusieAdenosine infuus: Maak een eerste voorraad van 20 mM adenosine in het basisperfusaat. Los de adenosine op door de tube in een warmwaterbad te plaatsen en te mengen door inversie. Verdun de voorraad adenosine verder tot een afstemming van 0,06 mg/ml in basisperfusaat en voeg dit toe aan een spuit van 50 ml. Bevestig een gevleugelde infuusnaald aan de spuit van 50 ml en sluit deze aan op de injectiepoort in het driewegventiel. Bevestig de spuit aan een spuitpomp en stel deze in op een infusiesnelheid van 166,6 μl/min.OPMERKING: Er komen luchtbellen vrij uit de infuuspoort door lichtjes op de poort te tikken of te tikken. Hoge druk perfusie:Isolatie van verpakte rode bloedcellen (pRBC’s):Verzamel 10-12 ml volledig rattenbloed via een hartpunctie van een donorrat. Centrifugeer het bloed op 2000 x g gedurende 10 minuten. Verwijder de plasma- en buffy-vachtlaag via pipetteren. Resuspendeer de pRBC’s in perfusaat zonder calciumchloride in een verhouding van 1:1 (bijv. 5 ml pRBC’s: 5 ml perfusaat) door inversiemenging. Herhaal de stappen 3.8.1.2-3.8.1.4 twee keer voor in totaal 3 wasbeurten. Na de laatste wasbeurt resuspendeert u de cellen in perfusaat in een verhouding van 1:1 en voegt u het mengsel toe aan het perfusiesysteem, dat al de 75 ml basisperfusaat bevat. Laat de cellen gelijkmatig door het systeem verdelen en meet de hematocriet van het perfusaat met behulp van een hematologiemachine. De hematocriet varieert van 5%-7%. 4. Voorbereiding van de verkrijging van een harttransplantaat Bereid het perfusiesysteem volledig voor voordat de verkrijging begint om de tijd van koude ischemie te minimaliseren. Bereid de chirurgische instrumenten voor. Chirurgische instrumenten zijn onder meer blauwe pads, chirurgische tape, zijden 5-0 hechtingen, wattenstaafjes, zoutoplossingspuiten (50 ml en 10 ml), operatieschaar, pincet, microschaar, micropincet, Halstead-klem, 30 U heparine, 16 G-slang voor portaalspoeling, 14 G-slang voor kanulatie van het hart, 16 G angiocath, gemodificeerde 14 G angiocath met manchet, druksensor, IJsemmer met ijs, 47 mm Petrischaaltje, gaas. Maak een aangepaste canule door een dunne ring van slangen (binnendiameter [ID] 0,167 mm, buitendiameter [OD] 2,42 mm) op de 14 G-canule te plaatsen, waardoor een mancheteffect ontstaat.Verwijder de naald van de canule en doe een druppel secondelijm onder de ring. Schuif de ring voorzichtig tot 1/4 inch boven de basis van de canule. Laat de lijm drogen voor gebruik. Knip de canule schuin zo dicht mogelijk bij de manchet af en verwijder scherpe randen. Vul een spuit van 60 ml met gehepariniseerde zoutoplossing (0,03 E/ml) voor poortaderspoeling. Sluit de spuit aan op de druksensor, gevolgd door de 16 G-spoelslang. Sluit een spuit van 10 ml gehepariniseerde zoutoplossing (0,03 E/ml) aan op de 14 G-slang. Sluit het andere uiteinde van de buis aan op de aortacanule en spoel deze door om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de aortacanule in een petrischaaltje van 47 mm met gaas en gevuld met zoutoplossing. Laat het petrischaaltje op ijs staan totdat het hart is aangesloten op het perfusiesysteem. 5. Verkrijging van harttransplantaat Verdoof de ratten in een verdovingskamer met 3% isofluraan. Zodra reflexen niet worden opgemerkt, verwijdert u de rat uit de kamer, plaatst u deze in de operatiekamer en dient u continu isofluraan (3%) toe via een gezichtsmasker. Na de teenknijptest hepariniseert u het dier via de penisader met 30 U heparine. Scheer de rat over de hele buik en de bovenkant van de borst. Verwijder de vachtkrullen uit het operatieveld. Plak elk ledemaat vast om ervoor te zorgen dat er tijdens de operatie geen beweging is. Maak een horizontale incisie in de middellijn in de huid van de onderbuik, waarbij de buikspieren bloot komen te liggen. Maak een tweede horizontale incisie in de buikspieren, waarbij de inwendige organen bloot komen te liggen. Onthul het borstbeen, zet het vast met een hemostaat en trek het craniaal terug om de lever en poortader bloot te leggen. Annuleer de poortader met behulp van een angiocath van 16 gauge. Bevestig de spuit van 60 ml met gehepariniseerde zoutoplossing aan de angiocath en maak een incisie in de inferieure vena cava en abdominale aorta voor ontluchting. Spoel de volledige hoeveelheid zoutoplossing door de poortader.OPMERKING: De spoeldruk moet rond de 10 mmHg blijven. Maak een horizontale snede in het middenrif, gevolgd door een proximale snede door de ribben aan beide zijden van het borstbeen om de borstholte te onthullen. Haal het hart uit de holte en leg het direct op de petrischaal met zoutoplossing op ijs. Identificeer de aortaboog, klem met hemostaten en leg de dalende aorta bloot door eventueel achtergebleven bindweefsel te reinigen. Maak een horizontale snede halverwege de dalende aorta en cannuleer met de 14 G angiocath.NOTITIE: Breek de aortaklep niet met de canule. Zet de canule vast via een hechting boven de manchet en laat de hemostaat los. Laat het hart op ijs liggen totdat het in het perfusiesysteem wordt geplaatst. 6. Initiatie van perfusie Stel het debiet van de slangenpomp in op 1,0 ml/min.OPMERKING: De aortacanule wordt altijd in een hoek van 90° ten opzichte van het hart gehanteerd om te voorkomen dat er belletjes in de kransslagaders terechtkomen (Figuur 1B). Weeg het hart met de canule voordat u het hart op het systeem bevestigt.OPMERKING: De aortacanule moet volledig vrij zijn van luchtbellen. Sluit de canule aan op de connector in het systeem en start een timer. Zodra het hart volledig is samengetrokken, verhoogt u de stroom met stappen van 0,2 ml/min terwijl u de druk nauwlettend in de gaten houdt. Stop met het verhogen van het debiet wanneer de gewenste druk is bereikt of totdat een minimum van 3.5 ml/min is bereikt.Lage druk perfusieGebruik voor drukken tussen 30-35 mmHg een debiet van 4,5 ml/min. Start de pomp van de adenosinespuit. Perfusie onder hoge drukGebruik voor drukken tussen 70-80 mmHg een minimaal debiet van 5.0 ml/min. Start de pomp van de adenosinespuit. 7. Intraventriculaire ballon: Bevestig een kleine (50 μL) latexballon aan een ballonkatheter (2 mm diameter, 15 cm lang) met een taps toelopende punt (1,4 mm diameter). Sluit de katheter aan op een druksensor via een luer lock-connector en bevestig de hele opstelling aan een clampstandaard. Vul de ballon/katheter/druksensor met ongeveer 200 μL zoutoplossing via een spuit die aan het bovenste uiteinde van de druksensor is bevestigd en verwijder luchtbellen uit de sensor, katheter en ballon. Kalibreer de druksensor met behulp van een bloeddrukmeter. Maak een kleine horizontale incisie boven het linker atrium. Laat de ballon leeglopen door de spuit aan de bovenkant van de druksensor af te trekken en in de linker ventrikel te plaatsen. Start gegevensverzameling en blaas de ballon op totdat de diastolische druk 0 mmHg aangeeft. 8. Bemonstering Verzamel hartslag, aortastroom en coronaire druk na de eerste 20 minuten perfusie en daarna elk uur. 9. Einde/opruimen Aan het einde van de perfusie verwijdert u het hart uit het systeem en weegt u het voor een schatting van het oedeem. Snijd de top van het hart via een omtreksnede en vries deze snel in vloeibare stikstof voor analyses na perfusie. Snijd een omtrekstuk van het hart af voor histologische beeldvorming en kleuring. Gooi de rest van het hart en de canule weg. Spoel alle componenten van het systeem af door grote hoeveelheden gedeïoniseerd (DI) water aan het reservoir toe te voegen en de peristaltische pomp te laten draaien. Vang het water op in een externe emmer. Herhaal stap 9.4 twee tot drie keer. Spoel alle monsterpoorten en de slang van de druksensor grondig af. Vul het reservoir met 600 ml DI-water en 3 ml reinigingsmiddelpomp van laboratoriumkwaliteit door het hele systeem. Schakel de boiler, zuurstoftank en peristaltische pomp uit.