설치류 심장 이식편의 관류 시간 연장을 위한 수정된 Langendorff 관류

이 연구는 Massachusetts General Hospital의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었습니다. 1. 시스템 설계 버블 트랩, 저장소, 산소 공급기, 연동 펌프 및 물 순환기를 포함한 3개의 이중 재킷 구성 요소로 시스템을 조립합니다. 모든 재킷 구성 요소를 하나의 클램프 스탠드에 부착합니다. 실리콘 튜브를 사용하여 구성 요소를 두 개의 다른 순서로 순서대로 연결합니다(그림 1A).시퀀스 1 – 재킷을 통한 물의 흐름 패턴( 그림 1A의 실선):36G 튜브를 사용하여 물 순환기의 유출을 버블 트랩 재킷의 하단 입구에 연결합니다. 이렇게 하면 관류액이 심장에 도달하기 전에 적절한 온도(37°C)로 유지되는데, 이는 물이 시스템의 다른 구성 요소를 통과할 때 열을 잃기 때문입니다. 동일한 크기의 튜브를 사용하여 버블 트랩 재킷의 상단 입구를 저장소 재킷의 하단 입구에 연결합니다. 그런 다음 저장소 재킷의 상단 입구를 산소 발생기 재킷의 하단 입구에 연결합니다. 마지막으로 산소 공급기의 상단 입구를 물 순환기의 유입구에 연결합니다. 시퀀스 2 – 시스템을 통한 관류수의 흐름 패턴( 그림 1A의 점선)루어 커넥터를 16G 튜빙의 양쪽에 부착합니다. 첫 번째 끝을 저장소 바닥에 부착하고 연동 펌프 헤드를 통해 공급합니다. 다른 쪽 끝을 산소발생기 내의 실리콘 코일 입구 중 하나에 연결합니다. 산소발생기의 실리콘 코일의 두 번째 입구에서 양쪽 끝에 루어 잠금 커넥터가 장착된 16G 튜브의 두 번째 조각을 긴 돌출부가 있는 버블 트랩의 입구에 연결합니다. 루어 커넥터가 장착된 더 짧은 16G 튜빙 조각을 버블 트랩의 사용하지 않는 배출구에서 3방향 루어 잠금 밸브에 연결합니다. 3방향 밸브의 반대쪽에서 16G 튜빙 조각을 다른 쪽 끝에 있는 두 번째 루어 밸브에 연결합니다. 이 두 번째 밸브는 저장소 바로 위에 있습니다. 밸브의 반대쪽을 16G 이상의 튜브에 연결한 다음 압력 센서를 연결합니다. 더 작은 직경의 튜브(̃3.7mm)를 캐뉼라(14G 혈관 주사)에 대한 커넥터가 있는 3방향 밸브의 수직 포트에 연결합니다. 관류수는 대동맥 캐뉼라 연결을 통해 저장소로 다시 순환하기 전에 버블 트랩을 통해 저장소에서 산소 공급기로 흐릅니다. 2. 관류 물 준비 염기 관류수, 0.96% Krebs-Henseleit 완충액, 9.915mM 덱스트란, 25mM 중탄산나트륨, 1.054mM 소 혈청 알부민, 1% 펜 스트렙, 0.13% 인슐린, 0.02% 하이드로코르티손, 0.5% 헤파린 및 2.75mM 염화칼슘을 준비하고 증류수로 부피를 늘립니다. 3. 관류 시스템 설정 두 개의 10mL 주사기를 버블 트랩의 상단 및 측면 배출 포트에 연결합니다. 베이스 관류수(75mL)를 저장소에 추가합니다. 연동 펌프를 켜고 물 순환기를 37°C로 설정합니다. 산소(95%O2 및 5%CO2) 라인을 산소발생기의 세 번째 입구에 연결하고 관류물을 최소 pO2 400mmHg로 산소화합니다. 버블 트랩을 바로 지나 3방향 밸브의 수직 포트에 주입 포트를 고정합니다. 1mL 주사기가 있는 날개 달린 주입 바늘을 주입 포트(샘플링에 사용됨)에 연결합니다. 주입 포트를 가볍게 두드리거나 1mL 주사기로 관류액을 당겨 회로에 유입된 기포를 제거합니다. 염기 관류수가 온도 및 산소 수준까지 올라가면 생화학적 매개변수의 초기 판독을 수행하여 올바른 이온 농도(표 1)와 적절한 산소화를 보장합니다.알림: 용액을 온도(37°C)까지 올리고 적절한 가스 혼합물(95% O2, 5% CO2)로 산소를 공급한 후 이온 및 pH 수준을 읽어야 합니다. 연결된 튜브를 언클램프로 만들어 압력 센서를 영점으로 조정하고 열린 센서와 캐뉼라를 통한 관류액 흐름이 평형을 이루도록 합니다. 평형이 되면 센서 상자의 영점 버튼을 누르고 튜브를 다시 clamp 1mL/min – 15mL/분 범위의 유량에 대해 심장이 시스템에 부착되기 전에 기본 압력을 기록합니다. 저압 관류아데노신 점적: 베이스 관류액에 초기 20mM의 아데노신 스톡을 만듭니다. 튜브를 따뜻한 물 욕조에 넣고 반전으로 혼합하여 아데노신을 녹입니다. 스톡 아데노신을 베이스 관류액에 0.06mg/mL의 조합으로 더 희석하고 50mL 주사기에 추가합니다. 날개 달린 주입 바늘을 50mL 주사기에 부착하고 삼방향 밸브의 주입 포트에 연결합니다. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 주입 속도를 166.6μL/min으로 설정합니다.알림: 주입 포트에서 거품은 포트를 가볍게 두드리거나 튕기면 방출됩니다. 고압 관류:포장된 적혈구(pRBC) 분리:기증 쥐의 심장 천자를 통해 10-12mL의 전체 쥐 혈액을 수집합니다. 혈액을 2000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 피펫팅을 통해 플라즈마와 버피 코트 층을 제거합니다. 반전 혼합을 통해 염화칼슘이 없는 관액에 pRBC를 재현탁시킵니다(예: pRBC 5mL: 관수수 5mL). 3.8.1.2-3.8.1.4단계를 두 번 반복하여 총 3회 세탁합니다. 마지막 세척 후 1:1 비율로 관류액의 세포를 재현탁시키고 혼합물을 이미 75mL의 기본 관류액이 포함된 관류 시스템에 추가합니다. 세포가 시스템을 통해 고르게 분포하도록 하고 혈액학 기계를 사용하여 관류액의 헤마토크릿을 측정합니다. 헤마토크릿 범위는 5%-7%입니다. 4. 심장 이식편 조달 준비 저온 허혈 시간을 최소화하기 위해 조달을 시작하기 전에 관류 시스템을 완전히 프라이밍합니다. 수술 도구를 준비합니다. 수술 도구에는 파란색 패드, 수술용 테이프, 실크 5-0 봉합사, 면봉, 식염수 주사기(50mL 및 10mL), 수술용 가위, 겸자, 마이크로 가위, 마이크로 집게, Halstead 클램프, 헤파린 30U, 문맥 플러시용 16G 튜브, 심장 캐뉼레이션용 14G 튜브, 16G 혈관 구슬, 커프가 있는 수정된 14G 혈관 주입, 압력 센서, 얼음이 담긴 얼음 양동이, 47mm 페트리 접시, 거즈. 14G 캐뉼라에 얇은 튜빙 링(내경[ID] 0.167mm, 외경[OD] 2.42mm)을 삽입하여 커프 효과를 만들어 수정된 캐뉼라를 만듭니다.캐뉼라의 바늘을 제거하고 링 아래에 슈퍼 접착제 한 방울을 추가합니다. 링을 캐뉼라 바닥에서 1/4인치 위로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 사용하기 전에 접착제를 말리십시오. 캐뉼라를 커프에 가능한 한 가깝게 비스듬히 자르고 날카로운 모서리를 제거합니다. 문맥 세척을 위해 60mL 주사기에 헤파린화 식염수(0.03U/mL)를 채웁니다. 주사기를 압력 센서에 연결한 다음 16G 세척 튜브에 연결합니다. 헤파린화 식염수(0.03U/mL) 10mL 주사기를 14G 튜브에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 대동맥 캐뉼라에 연결하고 세척하여 기포를 제거합니다. 대동맥 캐뉼라를 거즈가 있는 47mm 페트리 접시에 넣고 식염수로 채웁니다. 심장이 관류 시스템에 연결될 때까지 페트리 접시를 얼음 위에 두십시오. 5. 심장 이식편 조달 3% 이소플루란이 있는 마취실에서 쥐를 마취합니다. 반사 작용이 눈에 띄지 않으면 챔버에서 쥐를 제거하여 수술 공간에 놓고 안면 마스크를 통해 연속 이소플루란(3%)을 전달합니다. 발가락 꼬집기 테스트 후 30U의 헤파린으로 음경 정맥을 통해 동물을 헤파린화합니다. 복부 전체와 가슴 위쪽 부위에 걸쳐 쥐를 면도하십시오. 수술 부위에서 털 부스러기를 제거하십시오. 수술 중 움직임이 없도록 각 팔다리에 테이프를 붙입니다. 하복부 피부를 수평으로 정중선을 절개하여 복부 근육을 노출시킵니다. 내부 장기를 노출시키는 복부 근육에 두 번째 수평 정중선을 절개합니다. 흉골을 드러내고 지혈제로 고정한 다음 두개골 쪽으로 수축시켜 간과 문맥을 노출시킵니다. 16 게이지 혈관 혈관을 사용하여 문맥을 캐뉼레이션합니다. 60mL 헤파린화 식염수 주사기를 혈관 주사기에 부착하고 하대정맥과 복부 대동맥을 절개하여 환기시킵니다. 문맥을 통해 식염수 전량을 씻어냅니다.알림: 세척 압력은 약 10mmHg로 유지되어야 합니다. 횡격막을 수평으로 절개한 다음 흉골 양쪽의 갈비뼈를 근위부로 절개하여 흉강이 드러납니다. 캐비티에서 심장을 제거하고 즉시 얼음에 식염수를 넣은 페트리 접시에 놓습니다. 대동맥궁을 확인하고, 지혈제를 삽입하고, 남아 있는 결합 조직을 청소하여 하행 대동맥을 노출시킵니다. 하행 대동맥을 가로질러 절반을 수평으로 절단하고 14G 혈관 주사로 캐뉼레이션합니다.알림: 캐뉼라로 대동맥 판막을 뚫지 마십시오. 커프 위의 봉합사를 통해 캐뉼라를 고정하고 지혈제를 방출합니다. 관류 시스템에 넣을 때까지 심장을 얼음 위에 두십시오. 6. 관류 시작 연동 펌프의 유량을 1.0mL/분으로 설정합니다.알림: 대동맥 캐뉼러는 관상 동맥에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 항상 심장에 대해 90° 각도로 처리됩니다(그림 1B). 심장을 시스템에 부착하기 전에 캐뉼라로 심장의 무게를 잰다.알림: 대동맥 캐뉼라에는 기포가 완전히 없어야 합니다. 캐뉼라를 시스템의 커넥터에 부착하고 타이머를 시작합니다. 심장이 완전히 수축하면 압력을 면밀히 관찰하면서 유량을 0.2mL/분 단위로 증가시킵니다. 원하는 압력에 도달하거나 최소 3.5mL/분에 도달할 때까지 유량 증가를 중지합니다.저압 관류30-35mmHg 사이의 압력의 경우 4.5mL/분의 유량을 사용합니다. 아데노신 주사기 펌프를 시작합니다. 고압 관류70-80mmHg 사이의 압력의 경우 최소 5.0mL/분의 유량을 사용하십시오. 아데노신 주사기 펌프를 시작합니다. 7. 뇌실 내 풍선: 작은(50μL) 라텍스 풍선을 테이퍼 팁(직경 1.4mm)이 있는 풍선 카테터(직경 2mm, 길이 1.4cm)에 부착합니다. 루어 잠금 커넥터를 통해 카테터를 압력 센서에 연결하고 전체 설정을 클램프 스탠드에 고정합니다. 압력 센서의 상단에 부착된 주사기를 통해 풍선/카테터/압력 센서에 약 200μL의 식염수를 채우고 센서, 카테터 및 풍선 내부의 기포를 제거합니다. 혈압계를 사용하여 압력 센서를 보정합니다. 좌심방 위에 작은 수평 절개를 합니다. 압력 센서 상단에 있는 주사기를 당겨 좌심실에 삽입하여 풍선을 수축시킵니다. 데이터 수집을 시작하고 이완기 압력이 0mmHg가 될 때까지 풍선을 팽창시킵니다. 8. 샘플링 관류 처음 20분 후와 그 후 매시간 심박수, 대동맥 흐름 및 관상 동맥 압력을 수집합니다. 9. 종료/정리 관류가 끝나면 시스템에서 심장을 제거하고 부종 추정을 위해 무게를 잰다. 원주 절단을 통해 심장의 정점을 절단하고 관류 후 분석을 위해 액체 질소에서 급속 동결합니다. 조직학적 이미징 및 염색을 위해 심장의 둘레 부분을 자릅니다. 나머지 심장과 캐뉼을 폐기하십시오. 저장소에 많은 양의 탈이온수(DI)를 추가하고 연동 펌프를 작동하여 시스템의 모든 구성 요소를 헹굽니다. 외부 양동이에 물을 모으십시오. 9.4단계를 2-3회 반복합니다. 모든 샘플 포트와 압력 센서 튜브를 철저히 헹굽니다. 시스템 전체에 600mL의 탈이온수와 3mL의 실험실 등급 세제 펌프로 저장소를 채웁니다. 온수기, 산소 탱크 및 연동 펌프를 끕니다.