げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流

この研究は、マサチューセッツ総合病院の動物管理および使用委員会(IACUC)に従って実施されます。 1. システム設計 バブルトラップ、リザーバー、酸素供給器、蠕動ポンプ、水循環器の3つのダブルジャケットコンポーネントを使用してシステムを組み立てます。 すべてのジャケット部品を1つのクランプスタンドに取り付けます。コンポーネントをシリコンチューブで2つの異なる順序で順番に接続します(図1A)。シーケンス 1 – ジャケットを通る水の流れパターン ( 図 1A の実線):36Gチューブを使用して、水循環器の流出をバブルトラップジャケットの下部入口に接続します。これにより、水がシステムの他のコンポーネントを通過するときに熱が失われるため、灌流液が心臓に到達する前に適切な温度(37°C)に保たれることが保証されます。 バブルトラップジャケットの上部インレットをリザーバージャケットの下部インレットに同じサイズのチューブを使用して接続します。 次に、リザーバージャケットの上部インレットを酸素供給器ジャケットの下部インレットに接続します。 最後に、酸素供給器の上部入口を水循環器の流入に接続します。 シーケンス 2 – システム内の灌流液のフロー パターン ( 図 1A の破線)ルアーコネクターを16Gチューブの両側に取り付けます。最初の端をリザーバーのベースに取り付け、蠕動ポンプヘッドに通します。もう一方の端を、酸素供給器内のシリコンコイルの入口の1つに接続します。 酸素供給器のシリコンコイルの2番目の入口にある、両端にルアーロックコネクタが取り付けられた16Gチューブの2番目の部分を、長い突起のあるバブルトラップの入口に接続します。 ルアーコネクターが取り付けられた短い16Gチューブを、バブルトラップの未使用の出口に接続して、3方向ルアーロックバルブに接続します。 三方弁の反対側で、16 G チューブの一部をもう一方の端に 2 つ目のルアーバルブで接続します。この2番目のバルブは、リザーバーのすぐ上にあります。バルブの反対側を16Gチューブに接続し、続いて圧力センサーを接続します。 小径のチューブ( ̃3.7 mm)を三方弁の垂直ポートに接続し、カニューレ(14 G血管カテーテル)へのコネクタを使用します。灌流液は、リザーバーからバブルトラップを通って酸素供給器に流れ、大動脈カニューレ接続を介してリザーバーに再循環します。 2. 灌流液の調製 ベース灌流液、0.96% Krebs-Henseleit Buffer、9.915 mM Dextran、25 mM 重炭酸ナトリウム、1.054 mM ウシ血清アルブミン、1% ペン溶連菌、0.13% インスリン、0.02% ヒドロコルチゾン、0.5% ヘパリン、および 2.75 mM 塩化カルシウムを調製し、蒸留水で容量に戻します。 3. 灌流システムのセットアップ 2つの10 mLシリンジをバブルトラップの上部と側面のベントポートに接続します。 ベース灌流液(75 mL)をリザーバーに加えます。蠕動ポンプをオンにし、水循環器を37°Cに設定します。 酸素(95%O2 および5%CO2)ラインを酸素供給器の3番目の入口に接続し、灌流液を最小pO2 の400mmHgまで酸素化します。 注入ポートをバブルトラップのすぐ過ぎたところにある三方弁の垂直ポートに固定します。1 mLシリンジで翼のある注入針を注入ポートに接続します(サンプリングに使用)。注入ポートを軽くたたくか、1 mLシリンジで灌流液を吸い込み、回路に導入された気泡を取り除きます。 ベース灌流液が温度と酸素レベルに達したら、生化学的パラメーターの初期読み取りを行い、正しいイオン濃度(表1)と適切な酸素化を確認します。注:イオンレベルとpHレベルは、溶液が温度(37°C)まで上昇し、適切なガス混合物(95%O2、5%CO2)で酸素化された後に読み取る必要があります。 接続されたチューブのクランプを解除して圧力センサーをゼロにし、開いたセンサーとカニューレを通る灌流液の流れを平衡化させます。平衡化したら、センサーボックスのゼロボタンを押して、チューブを再度クランプします。心臓がシステムに接続する前に、1 mL/分から15 mL/分の範囲の流量の基本圧を記録します。 低圧灌流アデノシン点滴:ベース灌流液中にアデノシンの初期20 mMストックを作成します。アデノシンを溶解するには、チューブを温水浴に入れ、反転して混合します。 ストックアデノシンをさらに希釈して、ベースパフュージで0.06 mg / mLのコンサートにし、50 mLシリンジに加えます。. 50mLシリンジに翼のある輸液針を取り付け、三方弁の注入口に接続します。シリンジをシリンジポンプに固定し、注入速度を166.6μL / minに設定します。注意: 気泡は、ポートを軽くタップまたはフリックすることで注入ポートから放出されます。. 高圧灌流:パック赤血球(pRBC)の単離:ドナーラットの心臓穿刺により、10〜12 mLの全ラット血液を採取します。 血液を2000 x g で10分間遠心分離します。 ピペッティングでプラズマとバフィーコート層を除去します。 pRBCを塩化カルシウムを含まないパフューセートに1:1の比率で再懸濁します(例:pRBC5 mL:パフューセート5 mL)。 手順3.8.1.2〜3.8.1.4を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。 最後の洗浄後、細胞を灌流液に1:1の比率で再懸濁し、すでに75 mLのベース灌流液が含まれている混合物を灌流システムに加えます。 細胞がシステム全体に均一に分布するようにし、血液学装置を使用して灌流液のヘマトクリットを測定します。ヘマトクリット値は5%〜7%の範囲です。 4. 心臓移植片の調達準備 調達を開始する前に灌流システムを完全にプライミングし、低温虚血時間を最小限に抑えます。 手術器具を準備します。手術用具には、ブルーパッド、サージカルテープ、シルク5-0縫合糸、綿棒、生理食塩水注射器(50mLおよび10mL)、手術用ハサミ、鉗子、マイクロハサミ、マイクロ鉗子、ハルステッドクランプ、30Uのヘパリン、門脈フラッシュ用の16Gチューブ、心臓のカニューレーション用14Gチューブ、16G血管腫、カフ付き修正14G血管カテーテル、圧力センサー、 氷入りアイスバケツ、47mmシャーレ、ガーゼ。 14Gカニューレにチューブの細いリング(内径[ID]0.167mm、外径[OD]2.42mm)を挿入して、カフ効果を生み出して、修正されたカニューレを作成します。カニューレの針を取り外し、リングの下に瞬間接着剤を一滴加えます。リングをカニューレの基部から1/4インチ上まで慎重にスライドさせます。接着剤を乾かしてから使用してください。 カニューレをカフにできるだけ近づけて斜めにカットし、鋭いエッジを取り除きます。 60 mLシリンジにヘパリン食塩水(0.03 U / mL)を充填して、門脈をフラッシュします。シリンジを圧力センサーに接続し、続いて16Gフラッシングチューブに接続します。 ヘパリン化生理食塩水(0.03 U/mL)の10 mLシリンジを14 Gチューブに接続します。チューブのもう一方の端を大動脈カニューレに接続し、フラッシュして気泡を取り除きます。 大動脈カニューレをガーゼ付きの47mmペトリ皿に入れ、生理食塩水で満たします。心臓が灌流システムに接続されるまで、ペトリ皿を氷の上に置いておきます。 5. 心臓移植片の調達 3%イソフルランを含む麻酔室でラットに麻酔をかけます。 反射神経が気づかれなくなったら、ラットをチャンバーから取り出し、手術スペースに配置し、フェイスマスクを介して連続的にイソフルラン(3%)を送達します。. つま先ピンチテストの後、30Uのヘパリンで陰茎静脈を通して動物をヘパリン化します。 腹部全体と胸の上部でラットを剃ります。手術野から毛皮の削りくずを取り除きます。手術中に動かないように、各手足をテープで留めます。 下腹部の皮膚に水平正中線を切開し、腹部の筋肉を露出させます。 腹筋に2回目の水平正中線切開を行い、内臓を露出させます。 胸骨を露出させ、止血器で固定し、頭蓋状に引っ込めて肝臓と門脈を露出させます。16ゲージの血管カテーテルを使用して門脈をカニューレします。 ヘパリン化生理食塩水の60mLシリンジを血管カテーテルに取り付け、下大静脈と腹部大動脈に切開してベントを行います。門脈を通して全量の生理食塩水を洗い流します。注:フラッシング圧力は約10mmHgにとどまる必要があります。 横隔膜に水平に切り込みを入れ、続いて胸骨の両側の肋骨を近位に切り込み、胸腔を露出させます。 心臓を空洞から取り出し、すぐに生理食塩水を氷に乗せたシャーレの上に置きます。 大動脈弓を特定し、止血剤でクランプし、残っている結合組織を洗浄して下行大動脈を露出させます。 下行大動脈の半分に水平に切り込みを入れ、14G血管動物でカニューレを切開します。注:カニューレで大動脈弁を破らないでください。. カフの上の縫合糸でカニューレを固定し、止血剤を放出します。 灌流システムに入れるまで、心臓を氷の上に残します。 6. 灌流開始 蠕動ポンプの流量を 1.0 mL/min に設定します。注:大動脈カニューレは、冠状動脈への気泡の導入を避けるために、常に心臓に対して90°の角度で取り扱われます(図1B)。 心臓をシステムに取り付ける前に、カニューレで心臓の重さを量ります。注:大動脈カニューレには気泡がまったくない必要があります。 カニューレをシステム内のコネクタに取り付け、タイマーを開始します。 心臓が完全に収縮したら、圧力を注意深く観察しながら、流量を0.2 mL / min刻みで増やします。 所望の圧力に達したとき、または最低3.5mL/minに達するまで、流量の増加を停止します。低圧灌流30〜35 mmHgの圧力の場合、4.5 mL / minの流量を使用します。 アデノシンシリンジポンプを始動します。 高圧灌流70〜80 mmHgの圧力の場合、最小流量は5.0 mL/minです。 アデノシンシリンジポンプを始動します。 7.脳室内バルーン: 先端がテーパー状(直径1.4mm)のバルーンカテーテル(直径2mm、長さ15cm)に小型(50μL)のラテックスバルーンを取り付けます。 カテーテルをルアーロックコネクタを介して圧力センサーに接続し、セットアップ全体をクランプスタンドに固定します。 バルーン/カテーテル/圧力センサーに約200μLの生理食塩水を圧力センサーの上端に取り付けられたシリンジで満たし、センサー、カテーテル、バルーンの内部から気泡を取り除きます。 血圧計を使用して圧力センサーを校正します。 左心房の上に小さな水平切開を行います。圧力センサーの上部にあるシリンジを引き出し、左心室に挿入してバルーンを収縮させます。 データ取得を開始し、拡張期血圧が0mmHgになるまでバルーンを膨らませます。 8. サンプリング 灌流の最初の20分後とその後1時間ごとに、心拍数、大動脈血流、冠動脈圧を収集します。 9. 終了/クリーンアップ 灌流の最後に、心臓をシステムから取り出し、浮腫の推定のために体重を量ります。 円周方向の切開により心臓の頂点を切断し、液体窒素で瞬間凍結して灌流後の分析を行います。 組織学的イメージングと染色のために、心臓の円周片を切断します。残りの心臓とカニューレを処分します。 大量の脱イオン水(DI)をリザーバーに加え、蠕動ポンプを作動させることにより、システムのすべてのコンポーネントをすすぎます。外部バケツに水を集めます。 手順9.4を2〜3回繰り返します。 すべてのサンプルポートと圧力センサーチューブを十分にすすいでください。 システム全体で 600 mL の DI 水と 3 mL のラボ用洗剤ポンプをリザーバーに充填します。 給湯器、酸素ボンベ、蠕動ポンプの電源を切ります。