מאמר זה מדגים את ההיתכנות של השגת זמני זילוח ארוכים יותר (4 שעות) של שתלי לב מורין ללא אובדן תפקוד על ידי הפעלת לחצי זילוח נמוכים יותר (30-35 מ”מ כספית) מאשר פיזיולוגיים (60-80 מ”מ כספית) במהלך לנגנדורף.
למרות התקדמות חשובה באבחון וטיפול במחלות לב וכלי דם (CVD), התחום זקוק בדחיפות למחקר מוגבר ולהתקדמות מדעית. כתוצאה מכך, חדשנות, שיפור ו / או ייעוד מחדש של ערכת כלי המחקר הזמינים יכולים לספק מיטות בדיקה משופרות לקידום המחקר. זילוח לנגנדורף הוא טכניקת מחקר בעלת ערך רב לתחום מחקר CVD שניתן לשנות כדי להתאים למגוון רחב של צרכים ניסיוניים. תפירה זו יכולה להיות מושגת על ידי התאמה אישית של מספר רב של פרמטרים זילוח, כולל לחץ זילוח, זרימה, perfusate, טמפרטורה, וכו ‘ פרוטוקול זה מדגים את הרבגוניות של זילוח לנגנדורף ואת ההיתכנות להשגת זמני זילוח ארוכים יותר (4 שעות) ללא אובדן תפקוד השתל על ידי ניצול לחצי זילוח נמוכים יותר (30-35 מ”מ כספית). השגת זמני זילוח ארוכים יותר ללא נזק לשתל ו / או אובדן תפקוד שנגרם על ידי הטכניקה עצמה יש פוטנציאל לחסל אלמנטים מבלבלים מתוצאות הניסוי. למעשה, בנסיבות מדעיות שבהן זמני זילוח ארוכים יותר רלוונטיים לצרכי הניסוי (כלומר, טיפולים תרופתיים, ניתוח תגובה אימונולוגית, עריכת גנים, שימור שתלים וכו’), לחצי זילוח נמוכים יותר יכולים להיות המפתח להצלחה מדעית.
תחום המחקר הקרדיווסקולרי ראה התקדמות חשובה באבחון וטיפול במחלות לב וכלי דם (CVD). עם זאת, למרות הירידה הכללית בהיארעות ובשיעורי התמותה, מחלות לב וכלי דם נותרו סיבת המוות המובילה בעולם 1,2. עובדה מדאיגה זו מדגישה את הצורך במחקר מוגבר ובהתקדמות מדעית, אשר ללא ספק תלויה בדיוק וביכולת החיזוי של כלי המחקר הזמינים. כתוצאה מכך, קיים צורך מתמיד בחדשנות, שיפור ו / או ייעוד מחדש של ערכת כלי המחקר. לדוגמה, זילוח לב מדרדר או לנגנדורף, טכניקה הזמינה לתחום במשך יותר ממאה שנה, ניתנת לשינוי בקלות כדי לכסות היקף גדול יותר של צרכים מדעיים ולהשיג מגוון רחב יותר של יישומים.
הבידוד של שתל הלב משאר האורגניזם במהלך זילוח לנגנדורף מספק מידה חשובה של שליטה על מגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים, כולל טמפרטורה, תמיסה במחזור, לחצי זילוח כליליים וכו ‘.3,4,5,6,7. המניפולציה של פרמטרים אלה מאפשרת סימולציה של מספר רב של תרחישי לב שניתן למנף להתקדמות מדעיתנוספת 5,8,9,10. מבין פרמטרים אלה, לחץ זילוח הוא ככל הנראה ההגדרה הניסיונית המתעלמת ביותר11.
במהלך לנגנדורף, לחצי זילוח מראים קשר ישיר עם קצב הלב, לחץ סיסטולי/דיאסטולי שיא וצריכת חמצן11. מתאם זה מספק שליטה ישירה ומדויקת על כמות העבודה המיוצרת על ידי שתלי הלב, אשר ניתן להתאים כדי לענות על הצרכים הניסיוניים הבודדים. למרות יכולת בקרה חשובה זו, התחום נמשך היסטורית לשימוש בלחצי זילוח גבוהים יותר (60-80 מ”מ כספית), מה שחשף את כל שתלי הלב לביקוש עבודה גבוה ללא קשר לצרכי הניסוי 8,12,13,14,15. ההשלכות של ביקוש גבוה שלא לצורך לעבודה נובעות מעקרון העל שעבודת יתר נוטה לגרום לכישלון בטרם עת. נראה שזה נכון במיוחד עבור שתלי לב המחוררים באמצעות לנגנדורף, שכן נראה כי האופי הלא פיזיולוגי של שיטה זו והיעדר תמיכת ההתאוששות הקיימת in vivo מחריפים את כישלון השתל. אובדן מוקדם מדי זה של תפקוד השתל מגביל את זמני הזילוח והניסוי באופן משמעותי. למעשה, בנסיבות שבהן זמני זילוח ארוכים יותר רלוונטיים יותר לצרכי הניסוי (כלומר, טיפולים תרופתיים, ניתוח תגובה אימונולוגית, עריכת גנים, שימור שתלים וכו’), ניתן לאפשר עבודה לבבית נמוכה יותר בתמורה לעמידות מוגברת של השתל.
פרוטוקול זה מדגים את ההיתכנות של ניצול לחצי זילוח נמוכים יותר (30-35 מ”מ כספית) במהלך לנגנדורף, כמו גם את ההשפעה המשמעותית שיש להם על תפקוד השתל הלבבי לאורך זמן בהשוואה ללחצי זילוח גבוהים יותר (60-80 מ”מ כספית). יתר על כן, הממצאים בכתב יד זה מדגישים את החשיבות של מתן עדיפות להתאמה אישית של מגוון רחב של פרמטרים של זילוח כדי לענות טוב יותר על צרכי הניסוי.
זילוח לנגנדורף היא טכניקה גמישה ביותר המאפשרת תפירה והתאמה מרשימות כדי לענות על מגוון רחב של צרכים ניסיוניים. תפירה זו מתאפשרת על ידי יכולת ההתאמה המשמעותית של רוב פרמטרי הזלוף, כולל לחצי זילוח. בשל אופיו המדרדר של לנגנדורף, לחצי זילוח שקולים ללחצי זילוח כליליים, הממלאים תפקיד חיוני בתפקוד הלב. לחצי זילוח כליליים (CPP) ידועים כשולטים ישירות בעבודת הלב, שכן מגוון רחב של מדדי לב (כלומר, לחץ חדר שמאל, התכווצות (dP / dtmax), מתח קיר, נוקשות חדרית) נמצאים ביחס ישר ל- CPP 16,17,18. מבחינה היסטורית, השדה השתמש בלחצי זילוח, ולמעשה CPP, בין 60 מ”מ כספית ל 80 מ”מ כספית בניסיון לחקות תנאים פיזיולוגיים 5,8,15,19,20,21. אולם האופי הלא-פיזיולוגי של זילוח מכונת ex-vivo מדרדר, בשילוב עם הביקוש הגבוה לעבודה, מוביל לאובדן שעות נוספות של תפקוד הלב (איור 3). לחלופין, לחצי זילוח נמוכים יותר (30-35 מ”מ כספית), למרות שאינם משכפלים במדויק את התנאים הפיזיולוגיים של לבבות חולדות in vivo, מפחיתים מטבעם את הביקוש לעבודה לבבית ומשיגים זמני זילוח ארוכים יותר (4 שעות) ללא אובדן שעות נוספות של תפקוד (איור 3), וירידה בבצקת השתלים (איור 2C). נראה כי השימוש בלחצי זילוח נמוכים יותר, למרות שהוא מסמל סטייה מה-CPP הפיזיולוגי, מספק יתרונות חשובים על פני השימוש בלחצי זילוח פיזיולוגיים, שכן ביטול אובדן תפקוד תלוי טכניקה קיים במהלך זילוח לנגנדורף משפר את הטכניקה למערכת מודל מדויקת וצפויה יותר עם פוטנציאל משמעותי לקידום מחקר הלב וכלי הדם. בפרט, תחומי המחקר המועילים ו / או דורשים זמני זילוח ארוכים יותר כדי להגיע לרלוונטיות מדעית (כלומר, טיפולים תרופתיים, ניתוח תגובה אימונולוגית, עריכת גנים, שימור שתלים נורמותרמיים וכו ‘) הופכים חשובים יותר ויותר במאבק נגד CVD.
זילוח לנגנדורף הוא ללא עוררין כלי חיוני לתחום המחקר הקרדיווסקולרי. לכן, יחד עם היתרונות המשמעותיים שטכניקה מדעית זו מציבה לקהילת המחקר, היא מגיעה עם רמה חשובה של מורכבות מדעית. למעשה, ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה הדורשים סטנדרטיזציה זהירה, בעיקר כדי למנוע נזק להשתלת לב לפני, במהלך ומיד לאחר תחילת הזלוף. הסיכוי הראשון לנזק לשתל אינו בולט במהלך שטיפת הווריד הפורטלי. סומק זה עם מלוחים heparinized נועד להסיר דם שלם ככל האפשר מן השתל הלב עם מטרה כפולה. ראשית, הוא משמש כדרך המתת חסד באמצעות exsanguination. שנית, הוא ממזער את סיכויי הקרישה בתוך השתל הלבבי במהלך השליפה, הקנולציה וההובלה, שכן ידוע שלדם שלם של חולדה יש זמני לבוש קצרים במיוחד22,23. עם זאת, לאחר מאות זילוח לב מוצלח, התברר כי הלחץ המופעל על אורגניזם החולדה במהלך השטיפה הוא בעל חשיבות מוחלטת, כאשר לחץ ההדחה האידיאלי הוא סביב 10 מ”מ כספית. נראה כי לחצים גבוהים יותר של שטיפת ורידים פורטליים גורמים לנזק לכלי הדם של שתל הלב, מה שמוביל להתנגדות מוגברת של כלי הדם (). התנגדות כלי דם גבוהה יותר גורמת למעשה ללחצי זילוח מטרה להגיע לקצבי זרימה נמוכים יותר. חוסר איזון זה בין הלחץ לבין הזרימה הכלילית מועבר בלחץ הדופק של החדר השמאלי המיוצר (LVPP), וכתוצאה מכך שונות משמעותית.
המקרה הבא של נזק אפשרי לשתל לב הוא במהלך חיבור השתל למערכת באמצעות החדרת בועות אוויר לתוך הכליליים. בועות אוויר יכולות להיווצר בקלות על-ידי טיפול לא נכון בלב המשומר (איור 1B) או הסרה לא נכונה של בועות ממערכת הזילוח במעלה הזרם של מלכודת הבועות24. בשל אופיו המדרדר של מערך זה, כל החדרה של אוויר תגרום לתסחיף אוויר לבבי, המוביל לעלבונות איסכמיים, פרפור, ולעתים קרובות מאוד, מוות השתל. לבסוף, השלב הקריטי האחרון להבטחת הצלחת הפרוטוקול מתרחש במהלך התחלת הזלוף. בשונה מהרוב הגדול של כתבי היד המדווחים על שימוש בלנגנדורף כטכניקה, התחלת הזלוף בפרוטוקול זה מתבצעת בזרימות נמוכות יחסית (1 מ”ל/דקה) עם עליות מצטברות (+0.2 מ”ל/דקה), המצדיקות שליטה מלאה בלחצי הזלוף 5,8,15,19,20,21 . עלייה הדרגתית זו בזרימה, ולכן בלחץ, היא קריטית מכיוון ששינויים פתאומיים בלחץ מגבירים באופן בלתי הפיך את התנגדות כלי הדם ומשנים את מאזן הזרימה/לחץ העדין.
התנגדות כלי דם גבוהה בזילוח לנגנדורף מבוקר לחץ היא בעלת משמעות רבה, מכיוון שלחצי זילוח המטרה מגיעים בזרימות נמוכות יותר, והשתלים גורמים לתת-ניקוב. ההסתמכות הגדולה על איזון מושלם זה בין זרימה ולחץ היא ככל הנראה המגבלה הגדולה ביותר של פרוטוקול זה, שכן כל נזק קודם לשתל, מכוון (כלומר, שימור קור ממושך, עלבון איסכמיה חמה, אוטם שריר הלב וכו ‘) או לא מכוון, מוביל להתנגדות מוגברת של כלי הדם. למעשה, פרוטוקול זה שימושי במיוחד למחקר שבו הניסוי מתחיל לאחר תחילת הזלוף (כלומר, טיפולים תרופתיים, ניתוח תגובה אימונולוגית, עריכת גנים, שימור שתל נורמותרמי וכו ‘) אך לא לפני. מגבלה זו היא דוגמה מושלמת לכך שלנגנדורף אינו מתאים לכל המטרות ויש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי להתאים פרמטרים של זילוח כדי לענות טוב יותר על צרכי הניסוי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון נדיב ל- S.N.T. מהמכונים הלאומיים לבריאות של ארה”ב (K99/R00 HL1431149; R01HL157803) ואיגוד הלב האמריקאי (18CDA34110049). אנו גם מודים בהכרת תודה על מימון מהמכון הלאומי לבריאות של ארה”ב (R01DK134590; R24OD034189), הקרן הלאומית למדע (EEC 1941543), מלגת אלינור ומיילס שור מבית הספר לרפואה של הרווארד, קרן משפחת פולסקי, פרס Claflin Distinguished Scholar מטעם הוועד המנהל של MGH למחקר, ו-Shriners Children’s Boston (מענק #BOS-85115).
5-0 Suture | Fine Scientific Tools | 18020-50 | |
14 G Angiocath | Becton Dickinson | 381867 | |
16 G Angiocath | Becton Dickinson | 381957 | |
24 mm Heart Chamber adaptors | Radnoti | 140132 | |
Balloon Catheter | Radnoti | 170423 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes- 10 mL | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Slip Tip Sterile Syringes- 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes- 50 mL | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
Clamp Holder | United Scientic | RTCLMP1 | |
Dextran | Sigma | 31389 | |
DIN8 Extension Cable | Iworx | SKU C-DIN-EXT | |
Falcon High Clarity 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
GSC Go Science Crazy Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientific | S13748 | |
Heart Chamber | Radnoti | 140160 | |
Heated Water Circulator bath | Cole Parmer | N/A | |
Heparin sodium Injection | Medplus | G-0409-2720-0409-2721 | |
Hydrocortisone | Solu-Cortef | MGH Pharmacy | |
Insulin | Humulin R | MGH Pharmacy | |
Insvasive Fluid Filled Blood Pressure Sensor | Iworx | SKU BP-10x | |
Iworx Data Acquisition System | Iworx | IX-RA-834 | |
Krebs-Henseleit Buffer | Sigma | K3753 | |
Left Ventricular Pressure Balloon | Radnoti | 170404 | |
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head for Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | VWR | MFLX77200-60 | |
Masterflex L/S Standard Digital Pump Systems | VWR | MFLX07551-30 | |
Membrane Oxygenating Chamber | Radnoti | 130144 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12H | |
Precision Pump Tubing-16 | VWR | MFLX96410-16 | |
Sodium Bicarobonate | Sigma | 5761 | |
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump | Harvard Aparatus | 88-3015 | |
Tygon Transfer Tubing | VWR | MFLX95702-03 |
.