改良 Langendorff 灌注延长啮齿动物心脏移植物的灌注时间

这项研究是在马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 之后进行的。 1. 系统设计 将系统与三个双夹套组件组装在一起，包括气泡收集器、储液器、氧合器、蠕动泵和水循环器。 将所有带夹套的组件连接到一个夹具支架上。以两种不同的顺序用硅胶管依次连接组件（图 1A）。序列 1 – 水流经夹套的流型（ 图 1A 中的实线）：使用 36 G 管将水循环器的出口连接到气泡捕集器夹套的底部入口。这将保证灌注液在到达心脏之前保持在适当的温度 （37 °C），因为水在流经系统的其他组件时会失去热量。 使用相同尺寸的管路将气泡捕集套的顶部入口连接到储液槽套的底部入口。 随后，将储液槽夹套的顶部入口连接到氧合器夹套的底部入口。 最后，将氧合器的顶部入口连接到水循环器的入口。 序列 2 – 灌注液通过系统的流型（ 图 1A 中的虚线）将鲁尔接头接头连接到 16 G 管的两侧。将第一端连接到储液罐的底部，并通过蠕动泵头进料。将另一端连接到氧合器内硅胶线圈的入口之一。 将第二根 16 G 管子（两端装有鲁尔锁连接器）连接到氧合器硅胶线圈的第二个入口处，连接到带有长突起的气泡捕集器的入口。 将一根较短的 16 G 管子（配有鲁尔接头）连接到气泡捕集器未使用的出口，并连接到三通鲁尔锁阀。 在三通阀的另一侧，将一根 16 G 管路与另一端的第二个鲁尔阀连接。第二个阀门位于储液罐的正上方。将阀的另一侧连接到更多的 16 G 管路，然后连接到压力传感器。 将较小直径的管子 （̃3.7 mm） 连接到三通阀的垂直端口，并带有套管 （14 G 血管导管） 的连接器。灌注液通过气泡捕集器从储液器流向氧合器，然后通过主动脉插管连接再循环回储液器。 2. 灌注液制备 制备基础灌注液、0.96% Krebs-Henseleit 缓冲液、9.915 mM 葡聚糖、25 mM 碳酸氢钠、1.054 mM 牛血清白蛋白、1% Pen 链球菌、0.13% 胰岛素、0.02% 氢化可的松、0.5% 肝素和 2.75 mM 氯化钙，并用蒸馏水定容。 3. 灌注系统设置 将两个 10 mL 注射器连接到气泡捕集阱的顶部和侧面通气口。 将基础灌注液 （75 mL） 添加到储液槽中。打开蠕动泵并将水循环器设置为 37 °C。 将氧气（95% O2 和 5% CO2）管线连接到氧合器中的第三个入口，并将灌注液充氧至最小 pO2 为 400 mmHg。 将进样口固定到三通阀的垂直端口上，紧接通过气泡阱。将带有 1 mL 注射器的带翼输液针连接到注射口（用于采样）。轻轻敲击进样口或用 1 mL 注射器抽取灌注液，以清除引入回路的任何气泡。 一旦基础灌注液达到温度和氧气水平，对生化参数进行初始读数，以确保正确的离子浓度（表 1）和适当的氧合。注：在溶液升温 （37 °C） 并用适当的气体混合物（95% O2、5% CO2）充氧后，必须读取离子和 pH 值。 松开连接的管子，将压力传感器归零，让灌注液流通过打开的传感器和套管达到平衡。平衡后，按下传感器盒中的归零按钮并重新夹紧管路。在心脏连接到系统之前记录 1 mL/min 至 15 mL/min 的流量基础压力。 低压灌注腺苷滴注：在基础灌注液中制备初始 20 mM 的腺苷储备液。将试管置于温水浴中并通过倒置混合来溶解腺苷。 在基础灌注液中进一步稀释储备腺苷至 0.06 mg/mL 的浓度，并将其添加到 50 mL 注射器中。 将带翼的输液针连接到 50 mL 注射器上，并将其连接到三通阀中的注射口。将注射器固定到注射泵上，并将其设置为 166.6 μL/min 的输注速度。注意：轻轻敲击或轻弹输液口，气泡会从输液口中释放出来。 高压灌注：浓缩红细胞 （pRBC） 分离：通过供体大鼠的心脏穿刺收集 10-12 mL 全大鼠血液。 将血液以 2000 x g 离心 10 分钟。 通过移液去除血浆和血沉棕黄层。 通过倒置混合，以 1：1 的比例（例如，5 mL pRBC：5 mL 灌注液）将 pRBC 重悬于不含氯化钙的灌注液中。 重复步骤 3.8.1.2-3.8.1.4 两次，总共洗涤 3 次。 最后一次洗涤后，以 1：1 的比例将细胞重悬于灌注液中，并将混合物添加到灌注系统中，其中已包含 75 mL 基础灌注液。 让细胞在系统中均匀分布，并使用血液学机器测量灌注液的血细胞比容。血细胞比容范围为 5%-7%。 4. 心脏移植物采购准备 在开始采购之前完全灌注灌注系统，以最大限度地减少冷缺血时间。 准备手术工具。手术工具包括蓝垫、手术胶带、丝绸 5-0 缝合线、棉签、生理盐水注射器（50 mL 和 10 mL）、手术剪刀、镊子、微型剪刀、微型镊子、Halstead 夹、30 U 肝素、16 G 门静脉冲洗管、14 G 心脏管、16 G 血管导管、带袖带袖带的改良 14 G 血管导管、压力传感器、 带冰的冰桶，47 mm 培养皿，纱布。 通过在 14 G 套管上插入一圈细管（内径 [ID] 0.167 毫米，外径 [OD] 2.42 毫米）来创建改良套管，从而产生袖带效果。取下套管的针头，在环下方加入一滴强力胶。小心地将环滑至套管底部上方 1/4 英寸处。使用前让胶水干燥。 将套管尽可能靠近袖带切成一定角度，并去除锋利的边缘。 用肝素化盐水 （0.03 U/mL） 填充 60 mL 注射器，用于门静脉冲洗。将注射器连接到压力传感器，然后连接到 16 G 冲洗管。 将 10 mL 肝素化盐水 （0.03 U/mL） 注射器连接到 14 G 试管中。将管子的另一端连接到主动脉插管并冲洗以去除任何气泡。 将主动脉插管放入带有纱布并充满盐水的 47 毫米培养皿中。将培养皿放在冰上，直到心脏连接到灌注系统。 5. 心脏移植物采购 在含有 3% 异氟醚的麻醉室中麻醉大鼠。 一旦没有注意到反射，将大鼠从腔室中取出，将其放入手术腔，并通过面罩连续输送异氟醚 （3%）。 脚趾捏试验后，用 30 U 肝素通过静脉对动物进行肝素化。 将大鼠的整个腹部和上胸部区域剃光。从手术区域去除毛皮屑。用胶带固定每个肢体，以确保手术过程中没有移动。 在下腹部皮肤上做一个水平中线切口，露出腹部肌肉。 在腹部肌肉上做第二个水平中线切口，露出内脏器官。 露出胸骨，用止血钳固定，然后颅缩回以露出肝脏和门静脉。使用 16 号血管导管插管门静脉。 将 60 mL 肝素化盐水注射器连接到血管腔上，并在下腔静脉和腹主动脉上切开一个切口进行通气。通过门静脉冲洗全量盐水。注意：冲洗压力应保持在 10 mmHg 左右。 在横膈膜上做一个水平切口，然后在胸骨两侧的肋骨上做一个近端切口，露出胸腔。 从腔中取出心脏，并立即将其放在装有盐水的培养皿上。 识别主动脉弓，用止血钳夹住，并通过清洁任何剩余的结缔组织来暴露降主动脉。 在降主动脉的中间做一个水平切口，并用 14 G 血管导管插管。注意：不要用套管破坏主动脉瓣。 通过袖带上方的缝合线固定套管并松开止血钳。 让心脏保持在冰上，直到放入灌注系统。 6. 灌注启动 将蠕动泵的流量设置为 1.0 mL/min。注意：主动脉插管始终与心脏成 90° 角处理，以避免将气泡引入冠状动脉（图 1B）。 在将心脏连接到系统之前，用套管称量心脏。注意：主动脉插管应完全没有任何气泡。 将套管连接到系统中的连接器并启动计时器。 一旦心脏完全收缩，以 0.2 mL/min 的增量增加流量，同时密切观察压力。 当达到所需压力或直到达到最小 3.5 mL/min 时，停止增加流量。低压灌注当压力在 30-35 mmHg 之间时，使用 4.5 mL/min 的流速。 启动腺苷注射泵。 高压灌注当压力在 70-80 mmHg 之间时，使用最小流速为 5.0 mL/min。 启动腺苷注射泵。 7. 脑室内球囊： 将一个小 （50 μL） 乳胶球球连接到带有锥形尖端（直径 1.4 mm）的球囊导管（直径 2 mm，长 15 cm）上。 通过鲁尔锁连接器将导管连接到压力传感器，并将整个装置固定到夹架上。 通过连接到压力传感器顶端的注射器，向球囊/导管/压力传感器注入大约 200 μL 生理盐水，并去除传感器、导管和球囊内部的气泡。 使用血压计校准压力传感器。 在左心房上方做一个小的水平切口。通过在压力传感器顶部拉出注射器并将其插入左心室来给球囊放气。 开始数据采集并给球囊充气，直到舒张压读数为 0 mmHg。 8. 采样 在灌注的前 20 分钟后以及此后每小时收集一次心率、主动脉血流和冠状动脉压力。 9. 结束/清理 在灌注结束时，从系统中取出心脏并称重以进行水肿估计。 通过圆周切割切开心脏心尖，并在液氮中快速冷冻，用于灌注后分析。 切下心脏的圆周部分用于组织学成像和染色。处理掉心脏和插管的其余部分。 向水箱中加入大量去离子 （DI） 水并运行蠕动泵，冲洗系统的所有组件。将水收集在外部桶中。 重复步骤 9.4 两到三次。 彻底冲洗所有样品端口和压力传感器管路。 在整个系统中，用 600 mL 去离子水和 3 mL 实验室级洗涤剂泵填充储液槽。 关闭热水器、氧气罐和蠕动泵。