القياس الكمي لموت الخلايا الناجم عن السيتوكين في عضويات القولون البشري باستخدام الفحص المجهري الفلوري الحي
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في موت الخلايا وقياسه في عضويات القولون البشرية استجابة للاضطرابات السامة للخلايا مثل السيتوكينات. يستخدم هذا النهج صبغة موت الخلايا الفلورية (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ، والمجهر الفلوري الحي ، وبرنامج تحليل الصور مفتوح المصدر لتحديد الاستجابات العضوية المفردة للمنبهات السامة للخلايا.
Abstract
يزداد موت الخلايا الظهارية المعوية (IEC) في المرضى الذين يعانون من أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) مثل التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD). هذا يمكن أن يسهم في عيوب في وظيفة الحاجز المعوي ، وتفاقم الالتهاب ، والتسبب المناعي للمرض. السيتوكينات وروابط مستقبلات الموت مسؤولة جزئيا عن هذه الزيادة في وفيات IEC. السيتوكينات ذات الصلة ب IBD ، مثل TNF-α و IFN-γ ، سامة للخلايا ل IECs بشكل مستقل ومجتمعة. يصف هذا البروتوكول مقايسة بسيطة وعملية لتحديد السمية الخلوية التي يسببها السيتوكين في عضويات القولون المشتقة من المريض باستخدام صبغة موت الخلايا الفلورية (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ، والمجهر الفلوري الحي ، وبرنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. نوضح أيضا كيفية استخدام النموذج الرياضي لاستقلال Bliss لحساب معامل تفاعل الاضطراب (CPI) بناء على السمية الخلوية العضوية. يمكن استخدام مؤشر أسعار المستهلك لتحديد ما إذا كانت التفاعلات بين مجموعات السيتوكين أو أنواع أخرى من الاضطرابات معادية أو مضافة أو تآزرية. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول للتحقيق في النشاط السام للخلايا للسيتوكينات وغيرها من الاضطرابات باستخدام عضويات القولون المشتقة من المريض.
Introduction
تخلق ظهارة الأمعاء حاجزا ماديا شبه نافذ بين محتويات تجويف الأمعاء والأنسجة الكامنة. للحفاظ على هذا الحاجز بشكل فعال ، تخضع الخلايا الظهارية المعوية (IECs) لدوران خلوي مرتفع للغاية ، مع دورة مستمرة من موت الخلايا وتجديدها. ومع ذلك ، أثناء الاضطرابات الالتهابية ، مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، تحدث مستويات أعلى من موت الخلايا الشاذة1. هذا قد يعزز انهيار وظيفة الحاجز وتنشيط الجهاز المناعي ، مما يؤدي إلى مزيد من الالتهاب. في مرض كرون (CD) ، وهو شكل من أشكال مرض التهاب الأمعاء ، فقد ثبت أن إشارات السيتوكين تساهم في زيادة مستويات وفاة IEC2. من خلال دراسة كيفية تسبب إشارات السيتوكين في موت الخلايا في IECs ، من المأمول أن يتم تطوير علاجات محسنة للمرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء والاضطرابات الالتهابية المعوية الأخرى1.
في علم الأحياء وأبحاث اكتشاف هدف الدواء ، من المفهوم عموما أن التآزر يحدث عندما يظهر نظام بيولوجي معالج بمجموعات من المحفزات الفردية استجابة للتركيبة أكبر من التأثيرات المضافة المشتركة للمحفزات الفردية وحدها. تم توثيق التفاعلات التآزرية بين السيتوكينات بشكل جيد في قيادة الاستجابات الفطرية المضادة للفيروسات3. من المعروف أيضا أن السيتوكينات تحفز موت الخلايا بشكل تآزري ، بما في ذلك فيIECs 4. ومع ذلك ، فإن الدور الذي تلعبه إشارات السيتوكين السامة للخلايا التآزرية في الاضطرابات الالتهابية المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء غير مدروس.
العضويات المعوية البشرية هي الأنسجة الدقيقة 3D المنتجة في المختبر التي يتم إنشاؤها من الخلايا الجذعية الظهارية المعوية. يمكن زراعة العضويات المعوية من خزعات الغشاء المخاطي في الأمعاء التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء والاحتفاظ بالعديد من خصائص المرض 5,6. أثبتت المواد العضوية أنها نظام نموذجي مثالي لدراسة السمية الخلوية للسيتوكين في سياق التهاب الأمعاء 7,8. في السابق ، وصفت مجموعتنا تأثيرات القتل التآزرية للسيتوكينات ذات الصلة ب IBD IFN-γ و TNF-α في عضويات القولون المشتقة من المريض CD (colonoids) 9,10. ومع ذلك ، فإن الآليات الدقيقة التي ينطوي عليها التوسط في هذا الشكل من موت الخلايا التآزري لا تزال بعيدة المنال. هناك أيضا العديد من تفاعلات السيتوكينات السامة للخلايا غير المميزة ذات الصلة بالاضطرابات الالتهابية المعوية.
تتوفر العديد من البروتوكولات لدراسة موت الخلايا في الكائنات العضوية المعوية10،11،12،13 ؛ ومع ذلك ، لكل منهم عيوب. بعض هذه التقنيات تقيس فقط صلاحية الخلية ولا تقيس موت الخلايا مباشرة ، أو غير قادرة على تقييم استجابات العضو الواحد ، أو تتطلب معدات باهظة الثمن وبروتوكولات معقدة. هناك حاجة إلى منهجيات قوية ومباشرة لتحديد موت الخلايا العضوية وتفاعلات الاضطراب في الكائنات العضوية المعوية. البروتوكول الذي نقدمه هو نهج بسيط وغير مكلف لقياس استجابات العضو الواحد للسيتوكينات السامة للخلايا ولكن يمكن استخدامه لأي نوع من التحفيز أو الاضطرابات. نوضح أيضا كيفية استخدام نموذج تآزر استقلال Bliss لحساب معامل تفاعل الاضطراب (CPI) الذي يصف تفاعلات السيتوكين السامة للخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير عدة طرق للتحليلات الكمية لموت الخلايا في الكائنات العضوية المعوية. يعد فحص اضطراب مورفولوجيا الأعضاء المعوية بواسطة الفحص المجهري الضوئي نهجا مباشرا لتحديد آثار المواد السامة للخلايا11. ومع ذلك ، فإن التغيرات المورفولوجية ليست قياسا مباشرا لموت الخلايا ، والطريقة شبه كمية فقط. طريقة أخرى هي تقييم النشاط الأيضي العضوي باستخدام مقايسة MTT أو ATP 10,11. من المهم ملاحظة أن هذه المقايسات يمكنها فقط تحديد التغييرات في صلاحية الخلية ويجب التحقق من صحتها باستخدام مقايسة موت الخلية. تم الإبلاغ عن فحوصات موت الخلايا الفلورية الأخرى باستخدام أصباغ ربط الحمض النووي 12,13. من الممكن اتباع نهج غير تصويري باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية ويسمح بإنتاجية عالية12. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تقيس متوسط إشارة البئر بأكمله ، مما يجعلها غير مناسبة للسكان غير المتجانسين. كما يتطلب استخدام قارئ الصفائح الدقيقة مع تعديل ارتفاع Z. يمكن استخدام التقنيات القائمة على التصوير الفلوري لتحليل العضو المفرد والتقاط البيانات الخلوية / تحت الخلوية والمورفولوجية. يمكن لأنظمة التصوير الآلي عالي المحتوى (HCI) متحد البؤر توليد كميات كبيرة من البيانات بمعدل إنتاجية مرتفع13. لسوء الحظ ، يحتاج HCI متحد البؤر إلى معدات متخصصة ، ويستخدم بروتوكولات معقدة ، ويتطلب عادة برامج تحليل الصور التجارية ، وهو مكلف.
بروتوكولنا للتحليل الكمي لموت خلايا القولون في نقاط زمنية متعددة واضح وبسيط وغير مكلف. ومع ذلك ، بالمقارنة مع أنظمة HCI وقارئ اللوحات الآلية ، فإنها تستغرق وقتا طويلا وقد قللت من الإنتاجية. هناك قيد آخر لطريقتنا وهو استخدام المجال العريض بدلا من الفحص المجهري متحد البؤر. الفحص المجهري متحد البؤر هو أكثر ملاءمة لتصوير عينات 3D سميكة مثل المواد العضوية لأنه يقلل من إشارة خارج التركيز ويمكن الحصول على أقسام بصرية تسلسلية (Z-مداخن). ومع ذلك ، يتطلب التصوير البؤري عادة أوقات اكتساب أطول وأشعة ليزر عالية الكثافة تزيد من السمية الضوئية / التبييض الضوئي. من الأهمية بمكان ملاحظة أن أصباغ موت الخلايا الفلورية مثل SYTOX Green مناسبة فقط لقياس أشكال موت الخلايا حيث يوجد فقدان لسلامة غشاء الخلية مثل النخر ، والنخر الثانوي المرتبط بموت الخلايا المبرمج المتأخر ، والتنخر ، و pyroptosis21. هناك بعض أشكال موت الخلايا المنظم حيث يظل غشاء الخلية غير منفذ على الأقل خلال المراحل المبكرة من موت الخلايا ، مثل موت الخلايا المبرمج المعتمد على الكاسباس. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة ليشمل أيضا تصوير مراسل فلورسنت نشاط caspase 3/722. وهذا من شأنه أن يوفر بيانات إضافية للمساعدة في توصيف طريقة موت الخلية المحددة.
استخدمنا بروتوكولنا لإثبات التفاعل التآزري السام للخلايا بين السيتوكينات IFN-γ و TNF-α (الشكل 2C) ، والتي أبلغنا عنها سابقا في المواد العضوية المشتقة من المريضCD 9,10. كما تم إثبات الأهمية الفسيولوجية لهذا النوع من التآزر في نماذج الفئران من كثرة الخلايا اللمفاوية البلعمية والإنتان23. تم تنفيذ العديد من النماذج والنهج المرجعية الرياضية لقياس التآزر بين مجموعات العوامل البيولوجية24,25. وهي تختلف من حيث تعقيدها ، وعدد العوامل التي تأخذها في الاعتبار ، وعتبة اعتبار التفاعل تآزريا24,25. تحتاج بعض النماذج إلى معرفة مسبقة بالعوامل البيولوجية التي تم اختبارها ، وتضع افتراضات معينة حول نشاط العوامل ، ويمكن أن تتطلب منحنيات شاملة للجرعة والاستجابة لكل علاج فردي ومركب25. الطريقة التي اخترناها لقياس التآزر هي تعديل نموذج معامل التفاعل الدوائي (CDI) ، والذي تم استخدامه سابقا لقياس التأثيرات المثبطة لتركيبات أدوية العلاج الكيميائي على تكاثر خط الخلايا السرطانية26. CDI هو نموذج استقلال النعيم. عند حساب التأثير المشترك المتوقع لاثنين من الاضطرابات ، يفترض استقلال Bliss أنهما يستهدفان مسارات منفصلة ولديهما آليات عمل مستقلة27. لكي يكون التفاعل بين الاضطرابات تآزريا ، يجب أن يكون التأثير المشترك الفعلي أكبر من التأثير المتوقع. هذا النموذج مناسب لإعدادنا التجريبي حيث من المعروف أن IFN-γ و TNF-α لهما مستقبلات مختلفة ومكونات إشارات المصب. علاوة على ذلك ، يسمح استقلال Bliss بحساب معامل التفاعل لتحديد التآزر ولا يتطلب مجموعات بيانات استجابة الجرعة.
هناك بعض العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها لضمان النتائج المثلى لهذا البروتوكول. من المهم أن يتم نشر القولون إلى كثافة عالية (الشكل 1Bi) ، وأن يبلغ قطرها حوالي 25-50 ميكرومتر ، وتتكاثر بنشاط قبل محاولة زرع الخلايا. قد يؤدي استخدام الثقافات دون المستوى الأمثل للقولون للمقايسات إلى عدم كفاية أعداد الخلايا ، وانخفاض تعافي القولون ، وتجارب غير متسقة. للحصول على نتائج قابلة للتكرار ، من المهم أيضا زرع كثافة القولون باستمرار بين التجارب. لقد ثبت سابقا أن الاستجابة في المختبر للسيتوكينات الالتهابية يمكن أن تتأثر بكثافة بذر الخلايا28,29. مشكلة أخرى شائعة هي تكوين فقاعات الهواء في قبة BME ، والتي يمكن أن تؤثر على التصوير. يمكن منع ذلك باستخدام تقنية السحب العكسي. ينتج عن هذه التقنية أيضا بذر أكثر اتساقا.
علاوة على ذلك ، في حالة تصوير نقاط زمنية متعددة ، قم بإعداد حالة السمية القصوى لكل نقطة زمنية. يستخدم Triton-X 100 ، وهو خافض للتوتر السطحي غير أيوني ، بشكل شائع كعنصر تحكم إيجابي (حالة السمية القصوى) لمقايسات السمية الخلوية. إضافة Triton-X 100 lyses ويقتل القولون ، مما يسمح لصبغة موت الخلايا الفلورية بدخول الخلايا. سيؤدي استخدام حالة Max Toxicity من نقطة زمنية سابقة إلى تطبيع غير دقيق وغير متسق للبيانات بسبب تحلل إشارة الفلورسنت بمرور الوقت.
النقطة الأخيرة التي يجب مراعاتها هي اختيار BME المستخدم في ثقافة القولون. هناك العديد من المنتجين التجاريين ل BME. ومع ذلك ، بالنسبة لبروتوكولنا ، قمنا فقط باختبار العلامة التجارية المدرجة في جدول المواد. وجدت دراسة حديثة باستخدام عضويات سرطان البنكرياس المشتقة من المريض أن المصدر التجاري ل BME غير معدلات تكاثر الخلايا ولكن لم يكن له تأثير كبير على الاستجابة لأدوية العلاج الكيميائي أو التعبير الجيني30. مع وضع ذلك في الاعتبار ، نتوقع أن يكون اتجاه النتائج مشابها بين العلامات التجارية BME لبروتوكولنا ، لكننا نوصي باستخدام نفس العلامة التجارية باستمرار.
لقد أوضحنا كيف يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل موت الخلايا الناجم عن IFN-γ و TNF-α باستخدام القولون المشتق من CD. تعتبر العضويات المعوية المشتقة من المريض أداة قوية لدراسة CD لأنها تحتفظ بالعديد من خصائص المرض ، بما في ذلك زيادة الحساسية للتأثيرات السامة للخلايا ل TNF-α31. ومع ذلك ، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة للتحقيق في التأثيرات السامة للخلايا للاضطرابات بخلاف السيتوكينات أو حالات المرض بخلاف مرض التهاب الأمعاء مثل سرطان القولون والمستقيم (لقد اختبرنا البروتوكول بنجاح باستخدام القولون غير الالتهابي). نعتقد أن هذه الطريقة مفيدة لأي مجال بحثي معني بآليات موت الخلايا أو وظيفة الحاجز الظهاري أو المناعة المخاطية المعوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا المرضى على موافقتهم المستنيرة ومشاركتهم في الدراسة البحثية ، والموظفين السريريين على مساعدتهم الممتازة. تم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة العلوم في أيرلندا – وهي جائزة التطوير الوظيفي (CDA) إلى K.N. (SFI-13 / CDA / 2171) ، ومنحة مركز الأبحاث (SFI-12 / RC / 2273) ، وجائزة مركز الأبحاث (SFI-14 / SP / 2710) إلى APC Microbiome Ireland. وتلقى ب. ف. أيضا تمويلا من SFI/20/RP/9007.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Amphotericin B Solution | Sigma-Merck | A2942 | |
| A-83-01 | Sigma-Merck | SML0788 | |
| BioRender | Science Suite Inc. | N/A | Scientific illustration software |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Merck | A2058 | Essentially IgG-free, low endotoxin |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| CHIR-99021 | Sigma-Merck | SML1046 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3532-010-02 | Basement membrane extract |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Merck | D2650 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Merck | D8537 | |
| EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope | Invitrogen | AMF4300 | Digital inverted epifluorescence microscope |
| EVOS 40x Objective, fluorite, LWD, phase-contrast | ThermoFisher Scientific | AMEP4683 | Long working distance 40x fluorescence objective |
| Fiji/ImageJ (Windows version) | Open-source software | N/A | Image analysis software |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Merck | F9665 | |
| Gentamicin Solution | Sigma-Merck | G1397 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | Enzyme-free cell dissociation reagent |
| GlutaMAX-1 | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement |
| GraphPad Prism 5 (Windows version) | Dotmatics | N/A | Data graphics and statistics software |
| Greiner 15 mL Polypropylene Centrifuge Tube, Sterile with conical bottom & Screw Cap | Cruinn | 188261CI | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630080 | |
| Human recombinant EGF (animal free) | Peprotech | AF-100-15 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Merck | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Merck | N0636 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | Broad range antimicrobial reagent |
| Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 15543115 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF | Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA | Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA |
| SB202190 | Sigma-Merck | S7067 | |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3451 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain – 5 mM Solution in DMSO | Invitrogen | S7020 | Fluorescent cell death dye, protect from light |
| Triton X-100 | Sigma-Merck | 93420 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Merck | T8154 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604013 | Enzymatic dissociation reagent |
| Y-27632 | MedChemExpress | HY-10071 | Inhibitor of ROCK-I and ROCK-II |
References
- Patankar, J. V., Becker, C. Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).
- Zeissig, S., et al. Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn’s disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment. Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).
- Bartee, E., Mcfadden, G. Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity. Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).
- Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function. Gut. 45 (2), 191-198 (1999).
- Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease. Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).
- Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology – current applications and limitations. Eur J Immunol. 54 (2), e2250248 (2024).
- Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury. Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).
- Lee, C., et al. Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids. J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).
- Woznicki, J. A., et al. TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells. Cell Death Dis. 12 (10), 864 (2021).
- Flood, P., et al. DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5 (5), e1228 (2014).
- Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids. Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).
- Mertens, S., et al. Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer. Cell Rep. 42 (4), 112324 (2023).
- Vandussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Woznicki, J. A., et al. Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells. Cell Death Dis. 11 (1), 68 (2020).
- Edgar, R. D., et al. Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).
- Mubaid, F., Brown, C. M. Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic. Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).
- Ziegler, U., Groscurth, P. Morphological features of cell death. News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
- Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168.e17 (2021).
- Geary, N. Understanding synergy. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).
- Duarte, D., Vale, N. Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology. Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110 (2022).
- Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways. PLoS One. 8 (10), e78021 (2013).
- Ryall, K. A., Tan, A. C. Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations. J Cheminform. 7, 7 (2015).
- Sukho, P., et al. Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study. Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).
- Vaughan-Jackson, A., et al. Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages. Front Immunol. 13, 895488 (2022).
- Lumibao, J. C., et al. The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids. bioRxiv. , (2023).
- Lee, C., et al. TNFα induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn’s disease. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).
.