Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

I campioni di tessuto umano utilizzati nella tecnica descritta sono stati prelevati da pazienti sottoposti a inserimento di CIED secondo le linee guida secondo la pratica clinica di routine presso il Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Regno Unito). Il protocollo di studio, insieme a tutta la documentazione diversa, è stato approvato dal comitato etico locale (11/YH/0291) prima dell’arruolamento dei partecipanti. Lo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. 1. Popolazione di pazienti Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo fresco (SAT) durante l’impianto CIED da SAT sovrastante il muscolo grande pettorale. Isolare i campioni SAT in condizioni sterili e manipolare i campioni di tessuto dopo la raccolta in una cappa a flusso laminare in condizioni rigorosamente asettiche per prevenire la contaminazione batterica. 2. Isolamento e coltura di cellule endoteliali NOTA: Nella Figura 1 è mostrato uno schema per l’isolamento hSATMVEC. Per l’isolamento di hSATMVEC, utilizzare un minimo di 250 mg di tessuto adiposo sottocutaneo fresco (SAT) ottenuto durante l’impianto di CIED da SAT sovrastante il muscolo grande pettorale (vedi Figura 1).NOTA: L’uso di quantità maggiori di SAT fresco aumenta la resa di hSATMVEC durante l’isolamento e ha le maggiori possibilità di successo dell’isolamento e della coltura di hSATMVEC. Posizionare immediatamente SAT in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL in una soluzione di selezione cellulare attivata da magneto.NOTA: Per avere la massima probabilità di successo dell’isolamento, l’isolamento hSATMVEC deve essere eseguito il prima possibile. Tuttavia, il SAT può essere conservato per un massimo di 24 ore sul ghiaccio prima dell’isolamento, se necessario. Preparare una soluzione di lavoro da 1 mg/mL di collagenasi/dispasi come segue.In primo luogo, ricostituire 500 mg di polvere liofilizzata di collagenasi/dispasi in 5 mL di acqua sterile per formare una soluzione madre di collagenasi/dispasi con una concentrazione di 100 mg/mL. Per ogni isolamento di hSATMVEC, diluire 100 μL di soluzione madre di collagenasi/dispasi in 10 mL di soluzione fredda di sale bilanciato di Hanks per ottenere una soluzione di lavoro da 1 mg/mL. In una cappa a flusso laminare, utilizzare due bisturi per tritare i tessuti in ~1 mm3 pezzi in 500 μL di soluzione di collagenasi/dispasi da 1 mg/mL sul coperchio di una capsula di Petri, triturare e trasferire in una provetta da centrifuga pulita da 50 mL. Lavare il coperchio della piastra di Petri con 4,5 mL di soluzione fresca di collagenasi/dispasi da 1 mg/mL e aggiungere alla provetta da centrifuga da 50 mL. Lasciare digerire per 30 minuti a 37 °C in un rotatore di provette a 20 giri/min. Arrestare il processo di digestione aggiungendo 10 mL di terreno di crescita EC completo MV. Triturare la miscela digerita e passarla attraverso un setaccio cellulare da 70 μm. Sciacquare il setaccio con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,5% – tampone albumina sierica bovina (PBS-BSA). Centrifugare il campione a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio con altri 5 ml di PBS-BSA allo 0,5%. Quindi, rimuovere le cellule morte utilizzando un kit per la rimozione delle cellule morte. A tale scopo, incubare il pellet cellulare in 200 μL di perle di rimozione delle cellule morte (vortice prima dell’uso) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Collegare una colonna LS con un filtro da 30 μm al magnete separatore e posizionare una provetta da centrifuga da 15 mL al di sotto. Lavare una volta la colonna magnetica con 1 mL di tampone legante per la rimozione delle cellule morte prima di aggiungere la sospensione campione/perlina e lasciarla passare passivamente per gravità. Quindi, lavare la colonna aggiungendo 0,5 mL di tampone legante e lasciarla passare passivamente attraverso la colonna. Ripetere questo lavaggio quattro volte. Raccogliere l’eluato come frazione di cellule vive, centrifugare le cellule a 300 x g a RT per 10 minuti, quindi lavare e risospendere il pellet risultante in 400 μL di PBS-BSA allo 0,5%. Aggiungere 20 μl di microsfere magnetiche rivestite anti-CD31 alle celle sospese e incubare per 20 minuti a 4 °C. Dopo l’incubazione, centrifugare il campione a 300 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante. Risospendere il pellet della cella in 500 μl di PBS-BSA allo 0,5%. Collegare una colonna MS con un filtro da 30 μm al magnete separatore e posizionare una provetta da centrifuga da 15 mL al di sotto. Adescare la colonna con 500 μl di PBS-BSA allo 0,5%. Ripetere questo passaggio due volte. Aggiungere la sospensione di microsfere cellulari e lasciarla passare per gravità. Lavare la colonna con 500 μl di PBS-BSA allo 0,5% tre volte. Il flusso nella provetta da centrifuga sotto la colonna contiene la frazione CD31- . Per raccogliere la frazione CD31+ (cioè la frazione contenente hSATMVECs), rimuovere la colonna MS dal magnete separatore e inserirla in una provetta da centrifuga fresca da 15 mL. Aggiungere 1 mL di PBS-BSA allo 0,5% e, con un’azione fluida, applicare lo stantuffo della colonna per rilasciare gli hSATMVEC catturati. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di crescita EC completo MV e dividere la soluzione cellulare da 1 mL tra uno o due pozzetti (a seconda delle dimensioni del pellet) di una piastra a 24 pozzetti rivestita di gelatina al 2% (Passaggio 0).NOTA: Non preoccuparti se ci sono poche cellule aderenti nei primi giorni dopo l’isolamento. Cambia i media ogni 3 giorni. Colture cellulari a 37 °C con 5% di CO2. Una volta che le cellule isolate raggiungono una confluenza di ~80% (2-4 settimane), farle passare su un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti (passaggio 1).NOTA: I passaggi successivi possono ri-piastrare le cellule da un pozzetto donatore confluente a pozzetti riceventi. Gli esperimenti sono stati eseguiti su cellule di passaggio di 2-4 generazioni dopo che le cellule avevano dimostrato una purezza del >99% utilizzando la citometria a flusso (vedere paragrafo 3). Le cellule hanno mantenuto la tipica morfologia endoteliale almeno fino al passaggio 5. 3. Citometria a flusso Prima della citometria a flusso, controllare visivamente le hSATMVEC per assicurarsi che appaiano confluenti e morfologicamente rappresentative. Eseguire la valutazione citofluorimetrica delle hSATMVEC al passaggio 2, utilizzando le cellule di un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Lavare le celle due volte con PBS aggiungendo 500 μL di pozzetto di PBS e aspirando ogni volta. Quindi, aggiungere 300 μL/pozzetto di soluzione tiepida di tripsina/EDTA (0,25%). Incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 2 min. Una volta staccata, neutralizzare la soluzione di tripsina/EDTA con 700 μL di terreno di crescita EC completo MV e trasferirla in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 8 minuti a RT. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi, risospendere il pellet cellulare in un tampone MACS da 1 mL e dividerlo tra due provette per microcentrifuga da 1,5 mL etichettate con controllo non colorato e campione colorato (500 μL per pozzetto). Aggiungere altri 500 μl di tampone MACS a ciascuna provetta per microcentrifuga, prima di centrifugare nuovamente a 400 x g per 8 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 μl di tampone MACS per il controllo non colorato e in 100 μl di cocktail di colorazione (Tabella supplementare 1) per il campione colorato. Colorare le cellule con CD45-FITC (il marcatore pan-leucocitario), così come CD144-PE e CD31-PerCP (che sono espressi dalle cellule endoteliali). Agitare brevemente le cellule sospese per 5 s, quindi incubare a 4 °C per 10 minuti. Quindi, aggiungere 1 mL di tampone MACS a ciascuna provetta, centrifugare nuovamente a 400 x g per 8 minuti a RT ed eliminare il surnatante. Infine, risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone MACS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL. Posizionare la provetta etichettata in una ghiacciaia coperta pronta per l’analisi.NOTA: Tutte le analisi di citometria a flusso incluse sono state eseguite su un sistema di citometro a flusso a 4 laser Beckman Coulter Cytoflex (utilizzando solo il laser di eccitazione a 488 nm). Impostare la lunghezza d’onda massima di emissione e il filtro per ogni fluorocamera come segue: CD45-FITC – emissione massima 520 nm, filtro 525/50; CD144-PE – emissione massima 578 nm, filtro 585/40; CD31-PerCP – emissione massima 675 nm, filtro 655-730. Come illustrato nella Figura 2, registrare i dati per 10.000 cellule per campione in un gate singoletto (P2). Verificare che P1 circondi un ammasso di cellule principali e che la maggior parte di queste cellule cada nel gate singoletto P2. Assicurarsi che il controllo non colorato abbia un numero minimo di cellule CD45-CD144+CD31+ come % di singoletto. Registrare la percentuale di singoletti cellulari CD45-CD144+CD31+ nel campione colorato. 4. Tempo di raddoppio delle cellule endoteliali e proliferazione cellulare (Figura 3) Ai passaggi 2 e 3, contare il numero di hSATMVEC vitali per ciascun campione utilizzando l’emocitometria. Registra la data e l’ora di ogni conteggio delle celle. Calcola il numero di raddoppi della popolazione tra questi punti secondo l’equazione: tempo di raddoppio = (durata x log(2))/(log (concentrazione finale)-log(concentrazione iniziale)).NOTA: Un calcolatore online è disponibile all’indirizzo https://doubling-time.com/compute.php. Valutare la proliferazione delle hSATMVEC utilizzando un kit di imaging della proliferazione cellulare disponibile in commercio. Seminare hSATMVEC a una densità di 20.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e lasciarle per una notte in un mezzo di crescita EC completo MV per recuperare. Il giorno successivo, aggiungere 5-etil-2′-deossiuridina (EdU) a ciascun pozzetto diluito in terreno di crescita EC completo MV a una concentrazione finale di 10 μM. Incubare a 37 °C (5% CO2) per 2 ore. Rimuovere il terreno contenente EdU e lavare ogni pozzetto due volte con PBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a RT. Lavare ogni pozzetto due volte con PBS e aggiungere 500 μl di Triton X-100 allo 0,5% in tampone salino tris-tamponed (TBS). Lasciare incubare a RT per 20 min.NOTA: Questo permeabilizza la membrana cellulare, consentendo l’ingresso dell’azide marcata con Alexa fluor 488 nella cellula. Preparare il cocktail azide con etichetta Alexa fluor 488 secondo le istruzioni del produttore, a seconda del numero di pozzetti (vedere6). Lavare ogni pozzetto due volte con PBS prima di aggiungere 100 μL di cocktail di azide marcato con Alexa fluor 488 e incubare per 30 minuti a RT al riparo dalla luce.NOTA: Il cocktail azide Alexa fluorescente marcato con 488 reagisce con l’EdU in una reazione di clic. Rimuovi il cocktail azide etichettato Alexa fluor 488 e lavalo due volte con PBS. Aggiungere 500 μl di ioduro di propidio per pozzetto e incubare per 20 minuti a RT.NOTA: Questo passaggio contrasta la colorazione rossa dei nuclei (sia proliferanti che non proliferanti).Rimuovere lo ioduro di propidio, lavare due volte con PBS e lasciare ogni pozzetto in 500 μl di PBS per l’imaging. Immagine di ciascun pozzetto in 4 campi ad alta potenza con ingrandimento 10x, con eccitazione/emissione di 495/519 nm per l’azide di 488 nm (vedere la Figura 3C).NOTA: Le immagini nelle figure sono state catturate utilizzando un sistema di analisi di cellule vive con ingrandimento 10x e tempo di esposizione di 800 ms. Contare il numero di cellule proliferanti (verde) ed esprimere in percentuale (%) le cellule totali all’interno di ciascun campo ad alta potenza (media di 4 regioni per pozzetto). 5. Formazione del tubo cellulare endoteliale Lasciare Matrigel (matrice della membrana basale; BMM) per scongelare durante la notte su ghiaccio. Il giorno successivo, con la piastra in ghiaccio, aggiungere 160 μl di BMM a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, se necessario. Inclinare la piastra per ottenere una copertura completa di ogni pozzetto con BMM. Porre la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 da solidificare durante la preparazione delle cellule. Seminare hSATMVEC a 100.000 cellule (in 1 mL di terreno) per pozzetto. Pipettare a lato del pozzetto e fare attenzione a pipettare lentamente per evitare che la matrice si stacchi. Incubare la piastra a 37 °C con CO2 al 5% per 4 ore.NOTA: A questo punto, la lastra è pronta per essere ripresa. I risultati e le figure sottostanti l’imaging di fase sul sistema di analisi su cellule vive con ingrandimento 10x sono stati utilizzati in 5 diverse aree di pozzetti (vedi Figura 3D). Contare il numero di provette intere in ogni campo ad alta potenza e calcolare un valore medio per ogni campione. 6. Stimolazione insulinica di hSATMVEC Coltura di hSATMVEC in una piastra a 6 pozzetti a 37 °C con CO2 al 5%. Una volta confluente, rimuovere il terreno di coltura delle cellule endoteliali completo MV e lavare due volte con PBS. Aggiungere 500 μL di terreno di prova sierico (terreno di crescita delle cellule endoteliali MV senza integratori) a ciascun pozzetto e lasciare incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 4 ore. Durante questo periodo, preparare aliquote da 500 μL di concentrazioni crescenti di insulina (0-150 μM) preparate in terreni di carenza di siero. Dopo essere stati affamati di siero per 4 ore, rimuovere i terreni dai pozzetti, aggiungere 1 mL di terreno contenente insulina (con concentrazioni crescenti) a ciascun pozzetto e incubare per 10 minuti a 37 °C con CO2 al 5%. Lavare due volte con PBS freddo prima di aggiungere 100 μL di tampone di lisi proteica contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi per limare le cellule alla ricerca di proteine. Quantificare la proteina utilizzando il dosaggio BCA.NOTA: Nell’esperimento descritto di seguito, i lisati cellulari sono stati incubati per 30 minuti in un bagno di ghiaccio e centrifugati a 20.000 x g per 15 minuti. Prima dell’elettroforesi, i campioni di proteine sono stati fatti bollire per denaturare le proteine a 95 °C per 5 minuti. Le proteine sono state risolte su un gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris e trasferite su una membrana di nitrocellulosa. L’analisi immunoblot è stata eseguita secondo i protocolli standard utilizzando anticorpi fosfoproteici pertinenti e anticorpi proteici totali (secondo le istruzioni del produttore). Per rilevare l’anticorpo primario è stato utilizzato un anticorpo secondario Ig/HRP appropriato (secondo le istruzioni del produttore). I livelli di proteine sono stati quantificati utilizzando la densitometria in base all’intensità delle bande di ciascun campione. La ß-actina è stata utilizzata come controllo del carico, ove appropriato. 7. Impostazione della co-coltura hSATMVEC-adipociti (Figura 4) NOTA: Nei risultati seguenti, in tutti i test degli adipociti sono stati utilizzati preadipociti sottocutanei bianchi umani disponibili in commercio al passaggio 2 da un singolo donatore caucasico maschio. I preadipociti sono stati inizialmente espansi dalla fiala fornita dal fornitore (passaggio 0) in dodici crioviali contenenti mezzi di congelamento crio-SFM (passaggio 1). Ogni piastra di co-coltura a 24 pozzetti richiede un crioviale di preadipociti (passaggio 1). Scongelare rapidamente ogni flaconcino e piastra in un pallone T75 contenente 12-15 ml di terreno PGM-2 caldo (contenente il 10% di FBS, 30 μg/mL di L-glutammina e 15 ng/mL di GA-1000 SingleQuots). Cambia i media ogni 3 giorni fino al 90% di confluente. Una volta confluenti al 90%, lavare i preadipociti sottocutanei bianchi umani con PBS e quindi aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA (0,25%). Lasciare in RT per 2 min e confermare il distacco con microscopia ottica. Aggiungere 23 mL di terreno PGM-2 per neutralizzare la tripsina/EDTA e ottenere una soluzione sospesa per preadipociti da 24 mL. Mettere 1 mL di soluzione sottocutanea sospesa di preadipociti bianchi umani in ciascun pozzetto di una piastra di co-coltura a 24 pozzetti e far crescere fino alla confluenza (di solito 2-3 giorni). Durante la crescita fino alla confluenza, preparare i terreni di differenziazione preadipocitaria (PDM). Per preparare il PDM, creare un brodo PDM 2x aggiungendo una miscela brevettata di insulina, desametasone, indometacina e isobutilil-metilxantina ai terreni di base PGM. Diluire 2x PDM in un rapporto 1:1 con PGM per ottenere 1x PDM. Una volta confluenti, differenziare i preadipociti bianchi sottocutanei umani cambiando il terreno in 1 mL di terreno PDM 1x in ciascun pozzetto (Giorno 0). Lasciare incubare i preadipociti bianchi sottocutanei umani a 37 °C 5% CO2 per 10 giorni (senza modifiche del terreno) per differenziarli completamente. Monitorare la differenziazione utilizzando la microscopia in fase leggera (vedere la Figura 4B).NOTA: Gli adipociti differenziati non possono essere fatti passare e possono essere utilizzati per saggi dal giorno 10 al giorno 12. La differenziazione degli adipociti può essere misurata mediante amplificazione dell’mRNA di leptina, adiponectina e PPAR-γ. Il giorno 6 di differenziazione, seminare hSATMVEC a una densità di 5 x 104 cellule per inserto in 500 μL di terreno di crescita EC completo MV su inserti transwell (membrana da 0,4 μM). Posizionare gli inserti del pozzetto in un pozzetto con 500 μL di terreno di crescita EC completo MV () e crescere fino alla confluenza a 37 °C in CO2 al 5%. Il giorno 10, quando gli adipociti sono completamente differenziati, rimuovere metà del terreno PDM da ciascun pozzetto e trasferire gli inserti transwell contenenti hSATMVEC confluente nel proprio terreno (ECGM-MV) in ciascun pozzetto (vedere Figura 4A). Lasciare le cellule in co-coltura per 24 ore prima di rimuovere gli inserti transwell ed eseguire saggi per valutare la funzione degli adipociti.NOTA: A questo punto, gli adipociti possono anche essere lisati per l’isolamento di proteine o RNA, se necessario. 8. Assorbimento del glucosio da parte dell’adipocita 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)ammino)-2-desossiglucosio (2-NBD)-glucosio Dopo 24 ore di co-coltura, rimuovere gli inserti cellulari contenenti hSATMVEC. Quindi, aggiungere il glucosio 2-NBD al terreno in ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 20 μM. Proteggere dalla luce e incubare per 30 minuti a 37 °C con il 5% di CO2. Lavare le cellule due volte in PBS e fissare gli adipociti utilizzando 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 15 minuti a RT. Lavare le cellule tre volte in PBS prima di lasciarle in 100 μL di PBS.NOTA: A questo punto, gli adipociti sono pronti per essere visualizzati. Nelle figure incluse, l’imaging di fase e la luce verde (eccitazione 440-480 nm/emissione 504-544 nm) sono state ottenute sul sistema di analisi di cellule vive con un ingrandimento di 10x in quattro campi ad alta potenza (vedi Figura 4C). Quantificare il livello di assorbimento di glucosio quantificando la percentuale di verde dell’area totale utilizzando la soglia in ImageJ (o qualsiasi altro pacchetto software simile).