研究人类皮下脂肪组织中的脂肪内皮细胞/脂肪细胞串扰

所述技术中使用的人体组织样本是根据利兹教学医院 NHS 信托基金（英国利兹）的常规临床实践从接受指南指示插入 CIED 的患者中提取的。研究方案以及所有其他文件在参与者注册之前已获得当地伦理委员会 （11/YH/0291） 的批准。该研究是按照《赫尔辛基宣言》的原则进行的。 1. 患者群体 在 CIED 植入期间，从覆盖胸大肌的 SAT 获得新鲜的皮下脂肪组织 （SAT）。 在无菌条件下分离 SAT 样品，并在严格的无菌条件下在层流罩中处理收集后的组织样品，以防止细菌污染。 2. 内皮细胞分离和培养 注意：hSATMVEC 隔离示意图如图 1 所示。 对于 hSATMVEC 分离，使用至少 250 mg 新鲜皮下脂肪组织 （SAT），这些组织是在 CIED 植入期间从覆盖胸大肌的 SAT 获得的（见 图 1）。注：在分离过程中使用大量新鲜 SAT 可增加 hSATMVEC 的产量，并且成功分离和 hSATMVEC 培养的机会最高。 在转移到实验室之前，立即将 SAT 放入 1.5 mL 微量离心管中的冰冷磁激活细胞分选 （MACS） 组织储存溶液中。注意：为了获得成功分离的最高机会，应尽快进行 hSATMVEC 分离。然而，如果需要，SAT 可以在分离前在冰上储存长达 24 小时。 按如下方法制备 1 mg/mL 胶原酶/分散酶工作溶液。首先，在 5 mL 无菌水中配制 500 mg 胶原酶/分散酶冻干粉，形成浓度为 100 mg/mL 的胶原酶/分散酶原液。 对于每个 hSATMVEC 分离，在 10 mL 冷 Hanks′ 平衡盐溶液中稀释 100 μL 胶原酶/分散酶储备液，得到 1 mg/mL 工作溶液。 在层流柜中，使用两把手术刀在培养皿盖上的 500 μL 1 mg/mL 胶原酶/分散酶溶液中将组织切成 ~1 mm3 块，研磨并转移到干净的 50 mL 离心管中。 用 4.5 mL 新鲜的 1 mg/mL 胶原酶/分散酶溶液清洗培养皿盖，然后加入 50 mL 离心管中。在 37 °C 下在试管旋转器中以 20 rpm 消化 30 分钟。通过添加 10 mL 完全 EC 生长培养基 MV 来终止消化过程。 研磨消化的混合物，并将其通过 70 μm 细胞筛。用 10 mL 0.5% 磷酸盐缓冲盐水 – 牛血清白蛋白 （PBS-BSA） 缓冲液冲洗筛子。在室温下以 300 x g 离心样品 10 分钟，然后弃去上清液。再用 5 mL 的 0.5% PBS-BSA 重复此步骤。 然后，使用死细胞去除试剂盒去除死细胞。为此，将细胞沉淀在 200 μL 死细胞去除珠（使用前涡旋）中，在 1.5 mL 微量离心管中于室温 （RT） 中孵育 15 分钟。 将带有 30 μm 过滤器的 LS 色谱柱连接到分离磁体上，并在下方放置 15 mL 离心管。在加入样品/磁珠悬浮液之前，用 1 mL 死细胞去除结合缓冲液洗涤磁柱一次，并使其在重力作用下被动通过。 接下来，加入 0.5 mL 结合缓冲液洗涤色谱柱，使其被动通过色谱柱。重复此洗涤四次。 将洗脱液收集为活细胞组分，在 RT 下以 300 x g 旋转细胞 10 分钟，然后将所得沉淀在 400 μL 0.5% PBS-BSA 中洗涤并重新悬浮。 向悬浮细胞中加入 20 μL 抗 CD31 包被的磁珠，并在 4 °C 下孵育 20 分钟。孵育后，在 RT 下以 300 x g 离心样品 5 分钟，然后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 500 μL 0.5% PBS-BSA 中。 将带有 30 μm 过滤器的 MS 色谱柱连接到分离器磁力架上，并在下方放置 15 mL 离心管。用 500 μL 的 0.5% PBS-BSA 灌注色谱柱。重复此步骤两次。 加入细胞微珠悬浮液，使其在重力作用下通过。用 500 μL 的 0.5% PBS-BSA 洗涤色谱柱 3 次。色谱柱下方离心管中的流通液含有 CD31- 馏分。 要收集 CD31 + 馏分（即含有 hSATMVEC 的馏分），请从分离磁铁中取出 MS 柱，并将其放入新的 15 mL 离心管中。加入 1 mL 0.5% PBS-BSA，以一个平稳的动作，应用柱塞以释放捕获的 hSATMVEC。 在 RT 下以 300 x g 离心样品 5 分钟，然后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全 EC 生长培养基 MV 中，并将 1 mL 细胞溶液分装在 2% 明胶包被的 24 孔板（第 0 代）的一两个孔中（取决于沉淀大小）。注意：如果在分离后的最初几天内贴壁细胞很少，请不要担心。 每 3 天更换一次媒体。在 37 °C 和 5% CO2 下培养细胞。一旦分离的细胞达到 ~80% 汇合度（2-4 周），将它们传代到六孔板的单个孔中（第 1 代）。注：后续传代可以将细胞从一个汇合供体孔重新接种到受体孔。在使用流式细胞术证明细胞纯度为 >99% 后，在第 2-4 代传代细胞中进行实验（参见第 3 节）。细胞保持典型的内皮形态，至少直到第 5 代。 3. 流式细胞术 在流式细胞术之前，目视检查 hSATMVEC 以确保它们看起来汇合且具有形态学代表性。使用来自 6 孔板的单个孔的细胞，在第 2 代对 hSATMVEC 进行流式细胞术评估。 用 PBS 洗涤细胞两次，充分加入 500 μL PBS 并每次吸出。然后，加入 300 μL/孔的温胰蛋白酶/EDTA （0.25%） 溶液。在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 2 分钟。 分离后，用 700 μL 完全 EC 生长培养基 MV 中和胰蛋白酶/EDTA 溶液，然后转移到 1.5 mL 微量离心管中。 在 RT 下以 400 x g 离心细胞悬液 8 分钟。弃去上清液，不要干扰沉淀。接下来，将细胞沉淀重悬于 1 mL MACS 缓冲液中，并分装在两个标记为未染色对照和染色样品的 1.5 mL 微量离心管（每孔 500 μL）之间。 向每个微量离心管中额外添加 500 μL MACS 缓冲液，然后在室温下再次以 400 x g 离心 8 分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 μL MACS 缓冲液中（用于未染色对照）和 100 μL 染色混合物（补充表 1）用于染色样品。用 CD45-FITC（泛白细胞标志物）以及 CD144-PE 和 CD31-PerCP（由内皮细胞表达）对细胞进行染色。 将悬浮细胞短暂涡旋 5 秒，然后在 4 °C 下孵育 10 分钟。接下来，向每个试管中加入 1 mL MACS 缓冲液，在 RT 下再次以 400 x g 离心 8 分钟，然后弃去上清液。 最后，将细胞沉淀重悬于 500 μL MACS 缓冲液中，并将其转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。将标记的试管放入有盖的冰盒中，以备分析。注：包括的所有流式细胞术分析均在 Beckman Coulter Cytoflex 4 激光流式细胞仪系统（仅使用 488 nm 激发激光）上进行。 设置每个荧光管的最大发射波长和滤光片如下：CD45-FITC – 最大发射波长 520 nm，滤光片 525/50;CD144-PE – 最大发射波长 578 nm，滤光片 585/40;CD31-PerCP – 最大发射波长 675 nm，滤光片 655-730。 如图 2 所示，在单重态门 （P2） 中记录每个样品 10,000 个细胞的数据。检查 P1 是否围绕着一个主要的细胞簇，并且这些细胞中的大多数都落在 P2 单重态门中。确保未染色对照的 CD45-CD144+CD31 + 细胞占单重体的百分比最小。 记录染色样品中 CD45-CD144+CD31 + 细胞单细胞的百分比。 4. 内皮细胞倍增时间和细胞增殖（图 3） 在第 2 代和第 3 代，使用血细胞计数法计算每个样品的活 hSATMVEC 的数量。记录每个单元格计数的日期和时间。 根据以下公式计算这些点之间的种群倍增次数：倍增时间 = （持续时间 x log（2））/（log （最终浓度）-log（初始浓度））。注意：在线计算器可在 https://doubling-time.com/compute.php 获得。 使用市售的细胞增殖成像试剂盒评估 hSATMVECs 增殖。在 24 孔板中以每孔 20,000 个细胞的密度接种 hSATMVEC，并在完全 EC 生长培养基 MV 中放置过夜以恢复。 第二天，向每个孔中加入 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶 （EdU），在完全 EC 生长培养基 MV 中稀释，终浓度为 10 μM。在 37 °C （5% CO2 ） 孵育 2 小时。 取出含 EdU 的培养基，用 PBS 洗涤每个孔两次。在 RT 下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。用 PBS 洗涤每个孔两次，并在 tris 缓冲盐水 （TBS） 缓冲液中加入 500 μL 0.5% Triton X-100。在 RT 下孵育 20 分钟。注：这会透化细胞膜，允许 Alexa fluor 488 标记的叠氮化物进入细胞。 根据制造商的说明，根据孔的数量准备 Alexa fluor 488 标记的叠氮化物混合物（参见6）。用 PBS 洗涤每个孔两次，然后加入 100 μL Alexa fluor 488 标记的叠氮化物混合物，并在避光室下孵育 30 分钟。注：Alexa fluor 488 标记的叠氮化物混合物在点击反应中与 EdU 反应。 去除 Alexa fluor 488 标记的叠氮化物混合物，并用 PBS 洗涤两次。每孔加入 500 μL 碘化丙啶，并在室温下孵育 20 分钟。注：此步骤将细胞核（增殖和非增殖）复染为红色。去除碘化丙啶，用 PBS 洗涤两次，并将每个孔留在 500 μL PBS 中用于成像。 在 4 个高倍视野中以 10 倍放大倍率对每个孔进行成像，488 nm 叠氮化物的激发/发射波长为 495/519 nm（参见 图 3C）。注：图中的图像是使用活细胞分析系统以 10 倍放大倍率和 800 毫秒曝光时间捕获的。 计算增殖细胞的数量（绿色）并表示为每个高倍视野内总细胞的百分比 （%） （每孔平均 4 个区域）。 5. 内皮细胞管形成 离开 Matrigel（基底膜基质;BMM） 在冰上解冻过夜。第二天，将板置于冰上，根据需要向 24 孔板的每个孔中加入 160 μL BMM。倾斜板以用 BMM 完全覆盖每个孔。将板置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中，在制备细胞时凝固。 以每孔 100,000 个细胞（在 1 mL 培养基中）接种 hSATMVEC。在孔的侧面移液，并注意缓慢移液以避免基质脱落。将板在 37 °C 和 5% CO2 孵育 4 小时。注意：此时，板已准备好进行成像。下面的结果和图在活细胞分析系统上以 10 倍放大倍率进行相位成像，用于 5 个不同的孔区域（参见 图 3D）。 计算每个高功率场中整管的数量，并计算每个样品的平均值。 6. hSATMVEC 的胰岛素刺激 在 37 °C 和 5% CO2 的 6 孔板中培养 hSATMVEC。汇合后，去除完全内皮细胞生长培养基 MV 并用 PBS 洗涤两次。 向每个孔中加入 500 μL 血清饥饿培养基（不含补充剂的内皮细胞生长培养基 MV），并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 4 小时。在此期间，准备 500 μL 在血清饥饿培养基中制备的胰岛素浓度递增 （0-150 μM） 的等分试样。 血清饥饿 4 小时后，从孔中取出培养基，向每个孔中加入 1 mL 含胰岛素的培养基（浓度增加），并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 10 分钟。 用冷 PBS 洗涤两次，然后加入 100 μL 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白质裂解缓冲液以裂解细胞中的蛋白质。使用 BCA 测定定量蛋白质。注：在下面描述的实验中，将细胞裂解物在冰浴中孵育 30 分钟，并以 20,000 x g 离心 15 分钟。电泳前，将蛋白质样品在 95 °C 下煮沸以使蛋白质变性 5 分钟。在 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶上分离蛋白质，并转印到硝酸纤维素膜上。根据标准方案使用相关磷蛋白抗体和总蛋白抗体（根据制造商的说明）进行免疫印迹分析。使用合适的 Ig/HRP 二抗检测一抗（根据制造商的说明）。使用基于每个样品条带强度的光密度测定法对蛋白质水平进行定量。在适当的情况下，使用 ß-肌动蛋白作为负载对照。 7. hSATMVEC-脂肪细胞共培养设置（图 4） 注：在下面的结果中，来自单个雄性白种人供体的第 2 代市售人白色皮下脂肪细胞用于所有脂肪细胞测定。前脂肪细胞最初从供应商提供的冻存管（第 0 代）扩增到 12 个含有冷冻 SFM 冻存培养基的冻存管（第 1 代）中。 每个 24 孔共培养板需要一个前脂肪细胞冻存管（第 1 代）。将每个样品瓶和板快速解冻到含有 12-15 mL 温热 PGM-2 培养基（含有 10% FBS、30 μg/mL L-谷氨酰胺和 15 ng/mL GA-1000 SingleQuots）的 T75 培养瓶中。每 3 天更换一次培养基，直到 90% 汇合。 一旦 90% 汇合，用 PBS 洗涤人白色皮下前脂肪细胞，然后加入 1 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液 （0.25%）。在 RT 下放置 2 分钟，然后用光学显微镜确认脱离。加入 23 mL PGM-2 培养基以中和胰蛋白酶/EDTA，制成 24 mL 前脂肪细胞悬浮溶液。 将 1 mL 悬浮的人皮下白色前脂肪细胞溶液放入 24 孔共培养伴侣板的每个孔中，并生长至汇合（通常为 2-3 天）。 在生长至汇合的同时，准备前脂肪细胞分化培养基 （PDM）。为了制备 PDM，通过将胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和异丁基甲基黄嘌呤的专有混合物添加到 PGM 基础培养基中来制备 2x PDM 储备液。用 PGM 以 1：1 的比例稀释 2x PDM，制成 1x PDM。 汇合后，通过将培养基更换为 1 mL 1x PDM 培养基到每个孔中来区分人皮下白色前脂肪细胞（第 0 天）。将人皮下白色前脂肪细胞在 37 °C 5% CO2 下孵育 10 天（无培养基变化）以完全分化。使用光相显微镜监测分化（参见 图 4B）。注意：分化的脂肪细胞不能传代，可用于第 10 天至第 12 天的测定。脂肪细胞分化可以通过瘦素、脂联素和 PPAR-γ 的 mRNA 扩增来测量。 在分化第 6 天，将 hSATMVEC 以每个插入片段 5 x 104 个细胞的密度接种在 transwell 插入片段（0.4 μM 膜）上的 500 μL 完整 EC 生长培养基 MV 中。将 transwell 插入物放入装有 500 μL 完全 EC 生长培养基 MV （） 的孔中，并在 37 °C 和 5% CO 2 中生长至汇合。 在第 10 天，当脂肪细胞完全分化时，从每个孔中取出一半的 PDM 培养基，并将在其自己的培养基 （ECGM-MV） 中含有汇合 hSATMVEC 的 transwell 插入物转移到每个孔中（参见 图 4A）。 在取出 transwell 插入物并进行评估脂肪细胞功能的测定之前，将细胞置于共培养物中 24 小时。注：此时，如果需要，也可以裂解脂肪细胞以进行蛋白质或 RNA 分离。 8. 脂肪细胞 2-（N-（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖 （2-NBD）-葡萄糖摄取 共培养 24 小时后，去除含有 hSATMVEC 的细胞插入物。接下来，向每个孔中的培养基中加入 2-NBD-葡萄糖，以达到 20 μM 的最终浓度。避光并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 30 分钟。 在 PBS 中洗涤细胞两次，并在室温下使用 500 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定脂肪细胞 15 分钟。在 PBS 中洗涤细胞 3 次，然后留在 100 μL PBS 中。注意：此时，脂肪细胞已准备好进行成像。在包含的图中，相位成像和绿光（激发 440-480 nm/发射 504-544 nm）是在活细胞分析系统上以 10 倍放大倍率在四个高倍视野中获得的（参见 图 4C）。 通过使用 ImageJ（或任何其他类似软件包）中的阈值量化总面积的绿色百分比来量化葡萄糖摄取水平。