Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293
Summary
Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.
Abstract
I vettori virali adeno-associati (AAV) sono uno strumento straordinario per lo studio del sistema nervoso centrale (SNC). Capsidi innovativi, come l’AAV. PHP.eB, dimostrano un’ampia trasduzione del SNC mediante iniezione endovenosa nei topi. Per ottenere una trasduzione comparabile, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 1011 copie del genoma/topo) rispetto all’iniezione diretta nel parenchima del SNC. Nel nostro gruppo, la produzione di AAV, tra cui AAV. PHP.eB si basa su cellule HEK293T aderenti e sul metodo della tripla trasfezione. Ottenere rese elevate di AAV con cellule aderenti comporta un processo ad alta intensità di manodopera e materiale. Questo vincolo ha portato allo sviluppo di un protocollo per la coltura cellulare in sospensione in provette coniche. Gli AAV generati nelle cellule aderenti sono stati confrontati con il metodo di produzione della sospensione. Sono state confrontate colture in sospensione utilizzando reagenti di trasfezione polietilenimmina o TransIt. I vettori AAV sono stati purificati mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo seguita da scambio di tamponi e concentrazione utilizzando un filtro centrifugo. Con il metodo aderente, abbiamo ottenuto una media di 2,6 x 1012 copie del genoma (GC) totali, mentre il metodo della sospensione e la polietilenimmina hanno prodotto 7,7 x 1012 GC in totale e TransIt ha prodotto 2,4 x 1013 GC in totale. Non vi è alcuna differenza nell’efficienza di trasduzione in vivo tra i vettori prodotti con aderente rispetto al sistema di celle in sospensione. In sintesi, viene introdotto un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, che consente di ridurre il tempo e la manodopera necessari per la produzione di vettori e di ottenere rendimenti da 3 a 9 volte superiori utilizzando componenti disponibili presso i fornitori commerciali per scopi di ricerca.
Introduction
Il virus adeno-associato (AAV) è stato scoperto nel 1965 e da allora è stato utilizzato in una miriade di applicazioni1. Gli AAV sono stati applicati nella ricerca neuroscientifica per studiare la funzione genica e neuronale, mappare i neurocircuiti o produrre modelli animali per la malattia2. Tradizionalmente, questo viene fatto iniettando direttamente nel sito di interesse, poiché la maggior parte dei sierotipi naturali non attraversa la barriera emato-encefalica o ha bisogno di una dose elevata per farlo 1,2,3.
Con la scoperta dell’AAV. PHP.B4 e capsidi di nuova generazione come AAV. PHP.eB5 e AAV. CAP-B106, è possibile colpire il sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando una semplice iniezione sistemica. La mappatura spaziale rivela le cellule bersaglio dell’AAV. PHP.eB a livello cellulare 6,7. In combinazione con specifici promotori/potenziatori, questi capsidi offrono ampie opportunità ai neuroscienziati di studiare i geni e la funzione cerebrale mediante somministrazione non invasiva di AAV 4,8.
Mentre per l’AAV è necessaria una dose più bassa. PHP.eB (tipicamente da 1 a 5 x 1011 copie del genoma (GC)/topo) rispetto ad AAV9 (4 x 1012 GC/topo)7, è ancora necessario produrre più vettori rispetto alle strategie di iniezione diretta (tipicamente 1 x 109 GC/μL di iniezione). La maggior parte dei sierotipi naturali può essere prodotta utilizzando il classico sistema di coltura cellulare aderente in combinazione con la purificazione con iodixanolo 9,10,11,12. Per AAV. PHP.eB questo comporta un processo laborioso per la coltura e la trasfettazione delle cellule per ottenere vettori sufficienti per un esperimento8. Pertanto, è stata sviluppata la produzione di AAV in colture cellulari in sospensione in provette coniche. Le provette coniche, con una capacità fino a 300 ml, sono compatte, risparmiando spazio nell’incubatore e plastica. Le cellule in sospensione sono molto più facili da coltivare e maneggiare in grandi quantità rispetto alle cellule aderenti su piastre da 15 cm. I componenti di trasfezione del protocollo rimangono gli stessi. Pertanto, i plasmidi precedentemente utilizzati con il sistema aderente possono essere facilmente utilizzati in questo protocollo basato sulla produzione in cellule in sospensione. Il protocollo è stato trasferito con successo ad altri ricercatori in laboratorio e utilizzato con successo per vari capsidi e costrutti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La somministrazione sistemica di AAV è un potente strumento per il trasferimento genico al sistema nervoso centrale; tuttavia, la produzione di AAV è un processo costoso e laborioso. Utilizzando le cellule in sospensione, la manodopera e la plastica sono ridotte rispetto alla coltura aderente di HEK293T su piastre da 15 cm2 . Inoltre, i tubi conici qui implementati sono facili da maneggiare e massimizzano l’uso dello spazio del laboratorio. Il protocollo è stato messo a punto da due ricercatori e successiva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del fondo di ricerca dell’Accademia Reale Olandese delle Arti e delle Scienze (KNAW) e da una sovvenzione di Start2Cure (0-TI-01). Ringraziamo Leisha Kopp per il suo contributo e i suoi consigli nella configurazione del protocollo. Le figure sono state create utilizzando Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
