إنتاج دفعات ناقلات مرتبطة ب Adeno عالية الإنتاجية باستخدام خلايا تعليق HEK293
Summary
هنا ، يتم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على الخلايا HEK293 ، مما يؤدي إلى تقليل الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل باستخدام المكونات المتاحة لأغراض البحث من البائعين التجاريين.
Abstract
النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAVs) هي أداة رائعة للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي (CNS). قفيصات مبتكرة ، مثل AAV. PHP.eB ، تظهر نقيضا واسعا للجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن في الوريد في الفئران. لتحقيق نقل مماثل ، هناك حاجة إلى عيار أعلى بمقدار 100 ضعف (الحد الأدنى من 1 × 1011 نسخة جينوم / فأر) مقارنة بالحقن المباشر في حمة الجهاز العصبي المركزي. في مجموعتنا ، إنتاج AAV ، بما في ذلك AAV. يعتمد PHP.eB على خلايا HEK293T الملتصقة وطريقة النقل الثلاثي. إن تحقيق غلات عالية من AAV مع الخلايا الملتصقة يستلزم عملية كثيفة العمالة والمواد. دفع هذا القيد إلى تطوير بروتوكول لزراعة الخلايا القائمة على التعليق في الأنابيب المخروطية. تمت مقارنة AAVs المتولدة في الخلايا الملتصقة بطريقة إنتاج التعليق. تمت مقارنة الثقافة في التعليق باستخدام كواشف النقل Polyethylenimine أو TransIt. تم تنقية ناقلات AAV بواسطة الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول متبوعا بتبادل المخزن المؤقت والتركيز باستخدام مرشح الطرد المركزي. باستخدام طريقة الالتصاق ، حققنا متوسط 2.6 × 1012 نسخة جينوم إجمالا (GC) ، في حين أن طريقة التعليق و Polyethylenimine أنتجت 7.7 × 1012 GC في المجموع ، وأسفرت TransIt عن 2.4 × 1013 GC في المجموع. لا يوجد فرق في كفاءة النقل في الجسم الحي بين النواقل المنتجة مع الالتصاق مقارنة بنظام خلية التعليق. باختصار ، تم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على خلية التعليق HEK293 ، مما أدى إلى تقليل مقدار الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل مع تحقيق عوائد أعلى من 3 إلى 9 مرات باستخدام المكونات المتاحة من البائعين التجاريين لأغراض البحث.
Introduction
تم اكتشاف الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في عام 1965 ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في عدد لا يحصى من التطبيقات1. تم تطبيق AAVs في أبحاث علم الأعصاب لدراسة الجينات والوظيفة العصبية ، أو رسم خرائط للدوائر العصبية ، أو إنتاج نماذج حيوانية للمرض2. تقليديا ، يتم ذلك عن طريق الحقن مباشرة في موقع الاهتمام ، لأن معظم الأنماط المصلية الطبيعية لا تعبر حاجز الدم في الدماغ أو تحتاج إلى جرعة عالية للقيام بذلك1،2،3.
مع اكتشاف AAV. PHP.B4 والجيل التالي من القفيصات مثل AAV. PHP.eB5 و AAV. CAP-B106 ، من الممكن استهداف الجهاز العصبي المركزي (CNS) باستخدام حقن جهازي بسيط. يكشف رسم الخرائط المكانية عن الخلايا التي تستهدفها AAV. PHP.eB على المستوى الخلوي 6,7. بالاقتران مع المروجين / المعززات المحددة ، توفر هذه القفيصات فرصا واسعة لعلماء الأعصاب لدراسة الجينات ووظائف المخ عن طريق توصيل AAV غير الغازية 4,8.
في حين أن هناك حاجة إلى جرعة أقل ل AAV. PHP.eB (عادة من 1 إلى 5 × 1011 نسخة جينوم (GC) / ماوس) مقارنة ب AAV9 (4 × 1012 GC / ماوس) 7 ، لا يزال يتعين إنتاج المزيد من المتجهات مقارنة باستراتيجيات الحقن المباشر (عادة 1 × 109 GC / μL حقن). يمكن إنتاج معظم الأنماط المصلية الطبيعية باستخدام نظام زراعة الخلايا الملتصقة الكلاسيكي بالاشتراك مع تنقية اليوديكسانول9،10،11،12. ل AAV. PHP.eB يستلزم هذا عملية كثيفة العمالة لزراعة الخلايا ونقلها للحصول على ناقلات كافية لتجربة واحدة8. لذلك ، تم تطوير إنتاج AAV في زراعة الخلايا المعلقة في الأنابيب المخروطية. الأنابيب المخروطية ، بسعة تصل إلى 300 مل ، مدمجة ، مما يوفر مساحة الحاضنة والبلاستيك. خلايا التعليق أسهل بكثير في الزراعة والتعامل بكميات كبيرة من الخلايا الملتصقة على ألواح 15 سم. تظل مكونات النقل في البروتوكول كما هي. لذلك ، يمكن بسهولة استخدام البلازميدات المستخدمة سابقا مع النظام الملتصق في هذا البروتوكول بناء على الإنتاج في الخلايا المعلقة. تم نقل البروتوكول بنجاح إلى باحثين آخرين في المختبر واستخدم بنجاح لمختلف القفيصات والتركيبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإدارة الجهازية ل AAV هي أداة قوية لنقل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن إنتاج AAV هو عملية مكلفة وشاقة. باستخدام خلايا التعليق ، يتم تقليل العمالة والبلاستيك مقارنة بالثقافة الملتصقة HEK293T على ألواح 15 سم2 . علاوة على ذلك ، فإن الأنابيب المخروطية المنفذة هنا سهلة التعامل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنحة من صندوق أبحاث الأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (KNAW) ومنحة من Start2Cure (0-TI-01). نشكر ليشا كوب على مساهمتها ونصائحها في إعداد البروتوكول. تم إنشاء الأرقام باستخدام Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
