Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) se caractérise par une réduction progressive du nombre de lymphocytes T CD4⁺, ce qui entraîne une défaillance progressive de la réponse immunitaire. Le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est l’agent causal du sida. Il s’agit d’un virus à ARN simple brin enveloppé, de sens positif, avec deux copies d’ARN par virion et appartenant à la famille des rétroviridae. La production de fortes concentrations de protéines virales dans la cellule hôte exerce une pression excessive sur la machinerie de repliement des protéines de la cellule¹. Le RE est le premier compartiment de la voie sécrétoire des cellules eucaryotes. Il est chargé de produire, de modifier et de délivrer des protéines à la voie sécrétoire et aux sites cibles de l’espace extracellulaire. Les protéines subissent de nombreux changements post-traductionnels et se replient dans leur conformation naturelle dans le RE, y compris la glycosylation liée à l’asparagine et la création de liaisons disulfure intra- et intermoléculaires². Par conséquent, de fortes concentrations de protéines sont présentes dans la lumière du RE et celles-ci sont très sujettes à l’agrégation et au mauvais repliement. Diverses conditions physiologiques, telles que les chocs thermiques, les infections microbiennes ou virales, qui exigent une synthèse accrue des protéines ou une mutation des protéines, entraînent un stress du RE en raison de l’accumulation accrue de protéines dans le RE, perturbant ainsi l’homéostasie de la lumière du RE. Le stress du RE active un réseau de voies de transduction de signal adaptatives hautement conservées, la réponse protéique dépliée (UPR)³. L’UPR est utilisé pour ramener l’état physiologique normal du RE en alignant sa charge protéique dépliée et sa capacité de repliement. Ceci est provoqué par l’augmentation de la taille du RE et des chaperons et foldases moléculaires résidents du RE, ce qui entraîne une augmentation de la capacité de pliage du RE. L’UPR diminue également la charge protéique du RE grâce à l’atténuation globale de la synthèse des protéines au niveau traductionnel et augmente l’élimination des protéines dépliées du RE en régulant à la hausse la dégradation associée au RE (ERAD)^4,5.

Le stress du RE est détecté par trois protéines transmembranaires résidentes du RE : la protéine kinase R (PKR) du réticulum endoplasmique kinase (PERK), le facteur de transcription activateur 6 (ATF6) et l’enzyme de type 1 nécessitant l’inositol (IRE1). Tous ces effecteurs sont maintenus inactifs en se liant à la famille des protéines de choc thermique A (Hsp70) membre 5 (HSPA5), également connue sous le nom de protéine de liaison (BiP)/protéine régulée par le glucose de 78-kDa (GRP78). Lors d’un stress RE et d’une accumulation de protéines dépliées/mal repliées, HSPA5 se dissocie et conduit à l’activation de ces effecteurs, qui activent ensuite une série de cibles en aval qui aident à résoudre le stress RE et, dans des conditions extrêmes, favorisent la mort cellulaire⁶. Lors de la dissociation de HSPA5, PERK s’autophosphoryle et son activité kinase est activée⁷. Son activité kinase phosphoryle eIF2α, ce qui conduit à une atténuation translationnelle, abaissant la charge protéique de l’ER⁸. Cependant, en présence du facteur d’initiation phospho-eucaryote 2α (eIF2α), les cadres de lecture ouverts non traduits sur des ARNm spécifiques deviennent préférentiellement traduits, tels que ATF4, régulant les gènes induits par le stress. ATF4 et la protéine homologue C/EBP (CHOP) sont des facteurs de transcription qui régulent les gènes induits par le stress et régulent les voies d’apoptose et de mort cellulaire ^9,10. L’une des cibles d’ATF4 et de CHOP est la protéine d’arrêt de croissance et inductible par des dommages à l’ADN (GADD34), qui, avec la protéine phosphatase 1, déphosphoryle peIF2α et agit comme un régulateur de rétroaction pour l’atténuation translationnelle¹¹. Sous stress RE, ATF6 se dissocie de HSPA5 et son signal de localisation de Golgi est exposé, ce qui entraîne sa translocation vers l’appareil de Golgi. Dans l’appareil de Golgi, ATF6 est clivé par la protéase du site 1 (S1P) et la protéase du site 2 (S2P) pour libérer la forme clivée de l’ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 est ensuite transloqué dans le noyau, où il induit l’expression de gènes impliqués dans le repliement, la maturation et la sécrétion de protéines ainsi que dans la dégradation des protéines^12,13. Pendant le stress RE, IRE1 se dissocie de HSPA5, se multimérise et s’auto-phosphoryle¹⁴. La phosphorylation d’IRE1 active son domaine RNase, médiant spécifiquement l’épissage de 26 nucléotides à partir de la partie centrale de l’ARNm de la protéine de liaison X-box 1 (XBP1)^15,16. Cela génère un nouveau C-terminus conférant une fonction de transactivation, générant la protéine XBP1s fonctionnelle, un puissant facteur de transcription contrôlant plusieurs gènes induits par le stress du RE^17,18. L’activité combinée de ces facteurs de transcription active les programmes génétiques visant à restaurer l’homéostasie du RE.

Il existe différentes méthodes pour détecter le stress du RE et l’UPR. Il s’agit notamment des méthodes conventionnelles d’analyse des marqueurs UPR^19,20. Diverses méthodes non conventionnelles comprennent la mesure de l’état redox de l’UPR et de la distribution du calcium dans la lumière du RE, ainsi que l’évaluation de la structure du RE. La microscopie électronique peut être utilisée pour voir dans quelle mesure la lumière du RE s’agrandit en réponse au stress du RE dans les cellules et les tissus. Cependant, cette méthode prend du temps et dépend de la disponibilité d’un microscope électronique, qui peut ne pas être disponible pour tous les groupes de recherche. De plus, la mesure du flux de calcium et de l’état redox du RE est difficile en raison de la disponibilité des réactifs. De plus, les résultats de ces expériences sont très sensibles et pourraient être affectés par d’autres facteurs du métabolisme cellulaire.

Une technique puissante et simple pour surveiller les sorties de l’UPR consiste à mesurer l’activation des différentes voies de signalisation de l’UPR et est utilisée depuis des décennies dans divers scénarios de stress. Ces méthodes conventionnelles de mesure de l’activation de l’UPR sont économiques, réalisables et fournissent les informations en moins de temps que d’autres méthodes connues. Il s’agit notamment de l’immunoblot pour mesurer l’expression des marqueurs UPR au niveau des protéines, tels que la phosphorylation de IRE1, PERK et eIF2α et le clivage d’ATF6 en mesurant la forme P50 d’ATF6 et l’expression protéique d’autres marqueurs tels que HSPA5, XBP1 épissé, ATF4, CHOP et GADD34, ainsi que la RT-PCR pour déterminer les niveaux d’ARNm ainsi que l’épissage de l’ARNm XBP1.

Cet article décrit un ensemble validé et fiable de protocoles pour surveiller le stress du RE et l’activation de l’UPR dans les cellules infectées par le VIH-1 et pour déterminer la pertinence fonctionnelle de l’UPR dans la réplication et l’infectivité du VIH-1. Les protocoles utilisent des réactifs facilement disponibles et économiques et fournissent des informations convaincantes sur les résultats de l’UPR. Le stress du RE est le résultat de l’accumulation de protéines dépliées/mal repliées, qui ont tendance à former des agrégats de protéines²¹. Nous décrivons ici une méthode pour détecter ces agrégats de protéines dans les cellules infectées par le VIH-1. La coloration à la thioflavine T est une méthode relativement nouvelle utilisée pour détecter et quantifier ces agrégats de protéines^22. Beriault et Werstuck ont décrit cette technique pour détecter et quantifier les agrégats de protéines et, par conséquent, les niveaux de stress du RE dans les cellules vivantes. Il a été démontré que la petite molécule fluorescente thioflavine T (ThT) se lie sélectivement aux agrégats de protéines, en particulier aux fibrilles amyloïdes.

Dans cet article, nous décrivons l’utilisation de ThT pour détecter et quantifier le stress du RE dans les cellules infectées par le VIH-1 et le corrélons à la méthode conventionnelle de surveillance de l’UPR en mesurant l’activation de différentes voies de signalisation de l’UPR.

Étant donné qu’il y a également un manque d’informations complètes concernant le rôle de l’UPR pendant l’infection par le VIH-1, nous fournissons un ensemble de protocoles pour comprendre le rôle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion. Ces protocoles comprennent l’inhibition des marqueurs UPR par les lentivirus ainsi que le traitement avec des inducteurs de stress pharmacologiques du RE. Cet article montre également les types de lecture qui peuvent être utilisés pour mesurer l’expression du gène VIH-1, la production virale ainsi que l’infectivité des virions produits, tels que le test de luciférase basé sur la répétition terminale longue (LTR), le test d’immuno-absorption enzymatique p24 (ELISA) et le test de coloration rapporteur β-gal, respectivement.

En utilisant la majorité de ces protocoles, nous avons récemment rapporté l’implication fonctionnelle de l’infection par le VIH-1 sur l’UPR dans les cellules T²³, et les résultats de cet article suggèrent la fiabilité des méthodes décrites ici. Ainsi, cet article fournit un ensemble de méthodes pour obtenir des informations complètes sur l’interaction du VIH-1 avec le stress du RE et l’activation de l’UPR.