Test de complémentation basé sur Escherichia coli pour étudier la fonction chaperonne de la protéine de choc thermique 70

Les protéines de choc thermique jouent un rôle important en tant que chaperons moléculaires en facilitant le repliement des protéines, en empêchant l’agrégation des protéines et en inversant le mauvais repliement des protéines ^1,2. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est l’un des chaperons moléculaires les plus importants, jouant un rôle central dans l’homéostasie des protéines ^3,4. DnaK est l’homologue⁵ d’E. coli Hsp70.

Divers tests biophysiques, biochimiques et cellulaires ont été mis au point pour explorer l’activité chaperonne de Hsp70 et pour dépister les inhibiteurs ciblant ce chaperon ^6,7,8. Hsp70 est une protéine hautement conservée. Pour cette raison, plusieurs Hsp70 d’organismes eucaryotes, tels que Plasmodium falciparum (le principal agent du paludisme), ont été signalés comme substituant la fonction DnaK chez E. coli ^6,9. De cette manière, un test de complémentation basé sur E. coli a été développé impliquant l’expression hétérologue de Hsp70s chez E. coli pour explorer leur fonction cytoprotectrice. En règle générale, ce test implique l’utilisation de cellules E. coli qui sont soit déficientes pour le DnaK, soit qui expriment un DnaK natif qui est fonctionnellement compromis. Bien que le DnaK ne soit pas essentiel à la croissance d’E. coli dans des conditions normales, il devient essentiel lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions stressantes telles que des températures élevées ou d’autres formes de stress^10,11.

Les souches d’E. coli qui ont été développées pour étudier la fonction de Hsp70 à l’aide d’un test de complémentation comprennent E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr ::Tn10]) et E. coli dnaK756. Les cellules dnaK103 d’E. coli produisent un DnaK tronqué qui n’est pas fonctionnel, et en tant que tel, les cellules se développent correctement à 30 °C, tandis que la souche est sensible au stress dû au froid et à la chaleur^12,13. De même, la souche E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA ::TcR Pdm1,1) ne se développe pas au-dessus de 40 °C^14,15. La souche E. coli dnaK756 exprime un DnaK natif mutant (DnaK756) caractérisé par trois substitutions glycine-aspartate aux positions 32, 455 et 468, donnant lieu à des résultats protéostatiques compromis. Par conséquent, cette souche est résistante au bactériophage λ ADN¹⁴. De plus, E. coli dnaK756 présente une activité ATPase élevée, tandis que son affinité pour le facteur d’échange nucléotidique, GrpE, est réduite¹⁶. E. coli Les souches mutantes DnaK servent de modèles idéaux pour étudier l’activité chaperonne de Hsp70 par une approche de complémentation. Comme le DnaK n’est essentiel que dans des conditions stressantes, le test de complémentation est généralement effectué à des températures élevées (Figure 1). Parmi les avantages de l’utilisation d’E. coli pour cette étude, citons son génome bien caractérisé, sa croissance rapide et le faible coût de culture et d’entretien¹⁷.

Dans cet article, nous décrivons en détail un protocole impliquant l’utilisation de cellules E. coli dnaK756 pour étudier la fonction de Hsp70. Les Hsp70 que nous avons utilisés dans le test sont des DnaK de type sauvage et son dérivé chimérique, KPf (composé du domaine ATPase de DnaK fusionné au domaine de liaison au substrat C-terminal de Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18). KPf-V436F a été exprimé de manière hétérologue comme un contrôle négatif puisque la mutation l’empêche essentiellement de se lier aux substrats, abrogeant ainsi son activité chaperonne⁹.