Анализ комплементации на основе Escherichia coli для изучения шаперонной функции белка теплового шока 70

Белки теплового шока играют важную роль в качестве молекулярных шаперонов, облегчая сворачивание белков, предотвращая агрегацию белков и обращая вспять неправильное сворачивание белков ^1,2. Белок теплового шока 70 (Hsp70) является одним из наиболее известных молекулярных шаперонов, играющих центральную роль в белковом гомеостазе ^3,4. DnaK является гомологом E. coli Hsp70⁵.

Различные биофизические, биохимические и клеточные анализы были разработаны для изучения активности шаперона Hsp70 и скрининга ингибиторов, нацеленных на этот шаперон ^6,7,8. Hsp70 является высококонсервативным белком. По этой причине сообщалось, что несколько Hsp70 эукариотических организмов, таких как Plasmodium falciparum (основной возбудитель малярии), замещают функцию DnaK у E. coli ^6,9. Таким образом, был разработан анализ комплементации на основе E. coli, включающий гетерологичную экспрессию Hsp70 у E. coli для изучения их цитопротекторной функции. Как правило, этот анализ включает в себя использование клеток E. coli, которые либо испытывают дефицит ДНКК, либо экспрессируют нативный ДНКК, который функционально скомпрометирован. В то время как ДНКК не является необходимым для роста кишечной палочки в нормальных условиях, она становится необходимой, когда клетки выращиваются в стрессовых условиях, таких как повышенные температуры или другие^{формы стресса.}

Штаммы E. coli, которые были разработаны для изучения функции Hsp70 с помощью анализа комплементации, включают E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) и E. coli dnaK756. Клетки E. coli dnaK103 продуцируют усеченный DnaK, который не функционирует, и поэтому клетки адекватно растут при 30 °C, в то время как штамм чувствителен к холоду и тепловому стрессу^12,13. Аналогично, штамм E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) не поднимается выше 40 °C^14,15. Штамм E. coli dnaK756 экспрессирует мутантный нативный DnaK (DnaK756), характеризующийся тремя заменами глицина на аспартат в положениях 32, 455 и 468, что приводит к нарушенным протеостатическим результатам. Следовательно, этот штамм устойчив к бактериофагу λ ДНК¹⁴. Кроме того, E. coli dnaK756 проявляет повышенную активность АТФазы, в то время как ее сродство к фактору нуклеотидного обмена, GrpE, снижено¹⁶. Кишечная палочка Мутантные штаммы DnaK служат идеальными моделями для исследования активности шаперона Hsp70 с помощью комплементационного подхода. Поскольку ДНКК необходим только в стрессовых условиях, анализ комплементации обычно проводится при повышенных температурах (рис. 1). Некоторые преимущества использования E. coli для этого исследования включают ее хорошо охарактеризованный геном, быстрый рост и низкую стоимость культивирования и содержания¹⁷.

В этой статье мы подробно опишем протокол, предполагающий использование клеток E. coli dnaK756 для изучения функции Hsp70. Hsp70, которые мы использовали в анализе, представляют собой DnaK дикого типа и его химерное производное KPf (состоящее из АТФазного домена DnaK, слитого с С-концевым субстрат-связывающим доменом Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18). KPf-V436F был гетерологически экспрессирован как отрицательный контроль, поскольку мутация, по сути, блокирует его от связывания субстратов, тем самым отменяя его шаперонную активность⁹.