Generación, mantenimiento e identificación de modelos de pez cebra libres de gérmenes desde las larvas hasta las etapas juveniles

La microbiota (es decir, arqueas, bacterias, eucariotas y virus) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud del huésped y contribuye al desarrollo de diversas enfermedades al influir en los procesos fisiológicos y patológicos a través de interacciones simbióticas dentro de la barrera intestinal, la superficie epitelial y las funciones de la mucina en los individuos ^1,2,3. La composición de la microbiota en las diferentes etapas de la vida, desde la infancia hasta la juventud, la adultez y el envejecimiento, así como su presencia en diversos lugares, como las narinas, la boca, la piel y los intestinos, está moldeada dinámicamente por diversos hábitats y entornos⁴. La microbiota intestinal de los organismos está implicada en la absorción de nutrientes, la respuesta inmunitaria, la invasión de patógenos, la regulación metabólica, etcétera ^5,6. Los estudios en pacientes han demostrado que las alteraciones de la microbiota intestinal están relacionadas con la obesidad humana, los trastornos del sueño, la depresión, la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), las enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), el envejecimiento y diversos tipos de cáncer ^7,8,9. Además, las vías interactivas entre la microbiota intestinal y los huéspedes involucran factores inflamatorios, neurotransmisores, metabolitos, barrera intestinal y estrés oxidativo, como se observó en investigaciones anteriores con modelos de ratones y peces^10,11.

Recientemente, se han explorado múltiples enfoques o terapias relacionados con las bacterias, incluidos los posibles probióticos y el trasplante de microbiota fecal (TMF), para estos trastornos en modelos clínicos y animales. Estas exploraciones se basan en descubrimientos relacionados con el eje microbiota-intestino-cerebro/hígado/riñón, los productos derivados de la microbiota y la alteración de la actividad de los receptores^12,13. Sin embargo, el desarrollo, las diversas funciones y los mecanismos del sistema microbiota-huésped aún no se comprenden e identifican completamente debido a la complejidad de la comunidad microbiana y al desafío de generar modelos potentes de enfermedades similares a los humanos.

Para abordar estos problemas, a mediados^{del siglo XIX} se propusieron urgentemente modelos animales libres de gérmenes (GF) y se desarrollaron principalmente durante el siglo^XX. Los refinamientos posteriores, incluidos los modelos tratados con antibióticos y gnotobióticos, junto con los avances en las tecnologías de detección y observación microbiana, perfeccionaron aún más estos modelos 14,15,16. Los animales GF, creados borrando su propio fondo y evitando los microbios ambientales, ofrecen una excelente estrategia para explorar las interacciones entre los microorganismos y sus huéspedes¹⁷. A través de la aplicación de modelos animales y protocolos refinados, los investigadores han replicado con éxito composiciones microbianas similares encontradas en pacientes con ratones y peces GF. Además, otros modelos animales de GF, como perros, pollos y cerdos, ofrecen diversas opciones como sujetos de investigación 18,19,20,21. Este enfoque ha permitido investigar los posibles efectos terapéuticos de los microbiomas comensales en diversas enfermedades, incluida la inmunoterapia contra el cáncer en humanos^16,18. Los modelos GF ofrecen información más precisa sobre las características y los mecanismos de la colonización, migración, multiplicación e interacción bacteriana específica dentro de los huéspedes. Esto proporciona nuevos conocimientos cruciales sobre la aparición y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microbiota^22,23. La historia del establecimiento y la aplicación del pez cebra GF en la investigación microbiana ha evolucionado desde los informes de Rawls et al. en 2004 y Bates et al. en 2006 hasta el protocolo de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Sin embargo, la viabilidad de los modelos de GF adultos o reproductivos sigue siendo un proceso prolongado, acompañado de longevidad, tasas de éxito y desafíos de salud variables.

Entre varios modelos animales, el pez cebra (Danio rerio) se destaca como una herramienta crítica para la investigación básica y biomédica debido a su ventajosa similitud con los órganos humanos y la genómica, su corto ciclo de desarrollo, su alta fecundidad y sus embriones transparentes^19,26. El pez cebra, que sirve como modelo fiable de enfermedades humanas, ofrece una representación visual de los procesos fisiológicos y patológicos in vivo, proporcionando información sobre las atractivas características de las interacciones huésped-microbio. En particular, el pez cebra exhibe linajes celulares distintos, lo que permite obtener imágenes de la fisiología intestinal, la dinámica microbiana, las gónadas y el desarrollo reproductivo, la maduración del sistema inmunológico del huésped, el comportamiento y el metabolismo^. Los embriones de pez cebra se desarrollan dentro de coriones protectores hasta la eclosión, convirtiéndose en larvas a los 3 días después de la fertilización (dpf). Cazan activamente alimento a los 5 dpf y alcanzan la madurez sexual alrededor de los 3 meses después de la fertilización (mpf)²⁸. El primer pez cebra libre de gérmenes (GF) exitoso, reportado por Rawls et ^al.24, mostró que las larvas alimentadas con alimento esterilizado en autoclave después de la absorción de la yema exhibieron necrosis tisular a partir de 8 dpf y muerte total a 20 dpf. Esto indicó los efectos de la dieta o la importancia de considerar el suministro de nutrientes exógenos en experimentos con peces GF a largo plazo (>7 dpf)²⁹. Estudios posteriores mejoraron el protocolo de generación de peces GF, empleando alimentos estériles y métodos perfeccionados en diferentes modelos de peces¹⁶.

Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre modelos de pez cebra GF se han centrado en las primeras etapas de la vida, involucrando infección bacteriana a 5 dpf durante 24 h a 48 h, con muestras recolectadas antes de 7 dpf al final de los experimentos 25,30,31. Es ampliamente reconocido que la microbiota de los organismos, incluidos los humanos y el pez cebra, se coloniza al comienzo de la vida y se moldea durante el crecimiento y el desarrollo. La composición se mantiene estable en las etapas adultas, y el papel de la microbiota en el huésped es crucial a lo largo de la vida, especialmente en los aspectos relacionados con el envejecimiento, la obesidad neurodegenerativa, la obesidad metabólica y las enfermedades intestinales³. Por lo tanto, las perspectivas de los animales GF con una supervivencia más larga pueden proporcionar información sobre los mecanismos de los roles microbianos en el desarrollo y las funciones de los órganos del huésped, considerando los sistemas inmunológico y reproductivo inmaduros de las larvas de peces en los primeros años de vida. Si bien las cepas bacterianas en los intestinos del pez cebra se han aislado e identificado en estudios previos, lo que ofrece el potencial de infectar modelos animales GF para seleccionar probióticos o investigar las funciones bacterianas en el huésped^19,25, la generación y aplicación de modelos de peces GF se ha restringido principalmente a las primeras etapas de la vida. Esta limitación, atribuida al complejo proceso de producción, a los elevados costes de mantenimiento y a los problemas asociados con la alimentación y la inmunidad, dificulta los esfuerzos de investigación destinados a investigar los efectos crónicos y del desarrollo de la microbiota en el huésped.

La tasa de supervivencia, el comportamiento, el crecimiento, la maduración y la salud general de los peces, especialmente en modelos libres de gérmenes (GF), están significativamente influenciados por las prácticas de alimentación, que abarcan la ingesta y absorción de nutrientes durante el período de apertura de la boca desde las larvas tempranas hasta los juveniles^32,33. Sin embargo, uno de los desafíos en la cría de peces transgénicos es la escasez de dietas estériles adecuadas, lo que limita la efectividad del apoyo nutricional para mantener el crecimiento y la supervivencia de las larvas. Resolver este problema es crucial para restaurar la vida de los peces GF, teniendo en cuenta sus mecanismos de defensa del desarrollo y su débil capacidad de digestión debido a la ausencia de un microbioma intestinal. En términos de alimentación, el camarón de salmuera vivo (Artemia sp.) emerge como la dieta más adecuada para las larvas con la boca abierta a los peces juveniles. Se ha observado que los peces alimentados con camarones vivos exhiben mayores tasas de crecimiento y supervivencia en comparación con los alimentados con yema de huevo cocida u otros cebos naturales y sintéticos³⁴. Si bien los modelos de vida temprana de los peces GF pueden sobrevivir con el apoyo de la yema y los modelos de larvas GF pueden mantenerse con alimentación estéril, la generación de modelos a largo plazo desde larvas hasta juveniles y alcanzar la madurez sexual sigue siendo un desafío. Además, los alimentos en escamas o en polvo están limitados por una composición nutricional desigual y pueden afectar la calidad del agua. Por el contrario, la Artemia viva tiene ventajas como la supervivencia tanto en agua salada como dulce, tamaño pequeño adecuado para larvas y adultos, facilidad de procesamiento por lotes y mayor calidad de eclosión³⁵. Sobre la base de los métodos anteriores 16,24,30, hemos simplificado el complejo proceso de tratamiento y abordado el desafío de la dieta al establecer Artemia sp. viva GF fácilmente incubable como alimento estéril durante períodos más largos que los peces GF tempranos.

Este estudio presenta un protocolo optimizado que cubre (1) la generación, (2) el mantenimiento, (3) la identificación de la tasa de esterilidad y (4) el mantenimiento y la alimentación para garantizar el crecimiento del pez cebra libre de gérmenes (GF) desde los embriones hasta las larvas y las etapas juveniles. Los resultados ofrecen evidencia preliminar sobre la eclosión, supervivencia, crecimiento y esterilidad del pez cebra GF, junto con índices esenciales para GF Artemia sp. como alimento estéril. Los pasos detallados en la generación de modelos y la preparación de alimentos vivos estériles proporcionan un apoyo técnico crucial para la construcción y aplicación de modelos a largo plazo de peces GF, así como de GF Artemia sp. en la investigación de la interacción entre la microbiota y el huésped. El protocolo aborda el aislamiento, la identificación y la infección bacteriana en modelos de peces GF, describiendo métodos para el etiquetado de fluorescencia bacteriana y observando su colonización en los intestinos de los peces bajo un microscopio. Los peces GF, los peces gnotobióticos con infección bacteriana o los modelos de microbiota humana transferidos se someterán a diversas detecciones para dilucidar sus funciones y efectos sobre la inmunidad del huésped, la digestión, el comportamiento, la regulación transcriptómica y los aspectos metabólicos. A largo plazo, este protocolo puede extenderse a diferentes especies de peces de tipo salvaje, como la medaka marina, y potencialmente a otras líneas de pez cebra transgénicas seleccionadas correlacionadas con tejidos o enfermedades específicas.