Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Die Mikrobiota (d. h. Archaeen, Bakterien, Eukarya und Viren) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und tragen zur Entwicklung verschiedener Krankheiten bei, indem sie physiologische und pathologische Prozesse durch symbiotische Wechselwirkungen innerhalb der Darmbarriere, der Epitheloberfläche und der Muzinfunktionen bei Individuen beeinflussen ^1,2,3. Die Zusammensetzung der Mikrobiota in verschiedenen Lebensstadien, vom Säuglingsalter bis zur Jugend, dem Erwachsenenalter und dem Altern, sowie ihre Präsenz an verschiedenen Orten wie Nasenlöchern, Mund-, Haut- und Darmstellen wird dynamisch durch verschiedene Lebensräume und Umgebungen geprägt⁴. Die Darmmikrobiota in Organismen ist an der Nährstoffaufnahme, der Immunantwort, der Invasion von Krankheitserregern, der Stoffwechselregulation usw. beteiligt ^5,6. Studien an Patienten haben gezeigt, dass Störungen der Darmmikrobiota mit Fettleibigkeit beim Menschen, Schlafstörungen, Depressionen, entzündlichen Darmerkrankungen (CED), neurodegenerativen Erkrankungen (Parkinson, Alzheimer), Alterung und verschiedenen Krebsarten zusammenhängen ^7,8,9. Darüber hinaus umfassen interaktive Wege zwischen der Darmmikrobiota und den Wirten Entzündungsfaktoren, Neurotransmitter, Metaboliten, Darmbarriere und oxidativen Stress, wie in früheren Forschungen mit Mäuse- und Fischmodellen beobachtet^{wurde 10,11}.

In jüngster Zeit wurden mehrere bakterienbezogene Ansätze oder Therapien, einschließlich potenzieller Probiotika und fäkaler Mikrobiota-Transplantation (FMT), für diese Erkrankungen in klinischen und Tiermodellen untersucht. Diese Untersuchungen basieren auf Entdeckungen im Zusammenhang mit der Mikrobiota-Darm-Gehirn-/Leber-/Nierenachse, von der Mikrobiota abgeleiteten Produkten und einer veränderten Rezeptoraktivität^12,13. Die Entwicklung, die verschiedenen Funktionen und Mechanismen des Mikrobiota-Wirt-Systems sind jedoch aufgrund der Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und der Herausforderung, leistungsfähige menschenähnliche Krankheitsmodelle zu generieren, noch unvollständig verstanden und identifiziert.

Um diese Probleme anzugehen, wurden Mitte des 19^. Jahrhunderts dringend keimfreie (GF) Tiermodelle vorgeschlagen, die vor allem im 20^. Jahrhundert entwickelt wurden. Spätere Verfeinerungen, einschließlich antibiotikabehandelter und gnotobiotischer Modelle, sowie Fortschritte in der mikrobiellen Nachweis- und Beobachtungstechnologie perfektionierten diese Modelle weiter 14,15,16. GF-Tiere, die durch die Auslöschung ihres eigenen Hintergrunds und die Vermeidung von Umweltmikroben entstanden sind, bieten eine hervorragende Strategie, um die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und ihren Wirten zu erforschen¹⁷. Durch die Anwendung von Tiermodellen und verfeinerten Protokollen ist es den Forschern gelungen, ähnliche mikrobielle Zusammensetzungen zu replizieren, die bei Patienten in GF-Mäusen und -Fischen gefunden wurden. Darüber hinaus bieten andere Tiermodelle von GF, wie z. B. Hunde, Hühner und Schweine, vielfältige Optionen als Forschungsobjekte^an 18,19,20,21. Dieser Ansatz hat es ermöglicht, die potenziellen therapeutischen Wirkungen kommensaler Mikrobiome auf verschiedene Krankheiten, einschließlich der Krebsimmuntherapie beim Menschen, zu untersuchen^16,18. GF-Modelle bieten genauere Einblicke in die Eigenschaften und Mechanismen der spezifischen bakteriellen Besiedlung, Migration, Vermehrung und Interaktion innerhalb von Wirten. Dies liefert entscheidende neue Einblicke in das Auftreten und die Entwicklung von Mikrobiota-bedingten Krankheiten^22,23. Die Geschichte der Etablierung und Anwendung von GF-Zebrafischen in der mikrobiellen Forschung hat sich von den Berichten von Rawls et al. im Jahr 2004 und Bates et al. im Jahr 2006 bis zum Protokoll von Melancon et al. im Jahr 2017^entwickelt 16,24,25. Die Machbarkeit von adulten oder gezüchteten GF-Modellen ist jedoch immer noch ein langwieriger Prozess, der mit unterschiedlicher Langlebigkeit, Erfolgsraten und gesundheitlichen Herausforderungen einhergeht.

Unter den verschiedenen Tiermodellen sticht der Zebrafisch (Danio rerio) aufgrund seiner vorteilhaften Ähnlichkeit mit menschlichen Organen und Genomik, seines kurzen Entwicklungszyklus, seiner hohen Fruchtbarkeit und seiner transparenten Embryonen als wichtiges Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die biomedizinische Forschung hervor^19,26. Zebrafische, die als zuverlässige Krankheitsmodelle für den Menschen dienen, bieten eine visuelle Darstellung physiologischer und pathologischer Prozesse in vivo und geben Einblicke in die attraktiven Eigenschaften von Wirt-Mikroben-Interaktionen. Bemerkenswert ist, dass Zebrafische unterschiedliche Zelllinien aufweisen, die eine Abbildung der Darmphysiologie, der mikrobiellen Dynamik, der Gonaden und der Fortpflanzungsentwicklung, der Reifung des Immunsystems des Wirts, des Verhaltens und des Stoffwechsels ermöglichen²⁷. Zebrafischembryonen entwickeln sich bis zum Schlüpfen in schützenden Chorionen und werden 3 Tage nach der Befruchtung zu Larven (dpf). Sie jagen aktiv bei 5 dpf nach Nahrung und erreichen die Geschlechtsreife etwa 3 Monate nach der Befruchtung (mpf)²⁸. Der erste erfolgreiche keimfreie (GF) Zebrafisch, der von Rawls et ^al.24 berichtet wurde, zeigte, dass Larven, die nach der Dotterresorption mit autoklaviertem Futter gefüttert wurden, eine Gewebenekrose ab 8 dpf und einen vollständigen Tod bei 20 dpf aufwiesen. Dies deutete auf die Auswirkungen der Ernährung oder die Bedeutung der Berücksichtigung der exogenen Nährstoffversorgung in Experimenten mit Langzeit-GF-Fischen (>7 dpf) hin²⁹. Nachfolgende Studien verbesserten das Generationsprotokoll von GF-Fischen, indem steriles Futter und Methoden verwendet wurden, die in verschiedenen Fischmodellen perfektioniert wurden¹⁶.

Die meisten Forschungen an GF-Zebrafischmodellen konzentrierten sich jedoch auf frühe Lebensstadien, die eine bakterielle Infektion bei 5 dpf für 24 h bis 48 h beinhalteten, wobei Proben vor 7 dpf am Ende der Experimente entnommen wurden 25,30,31. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mikrobiota in Organismen, einschließlich Menschen und Zebrafischen, zu Beginn des Lebens besiedelt und während des Wachstums und der Entwicklung geformt wird. Die Zusammensetzung bleibt im Erwachsenenstadium stabil, wobei die Rolle der Mikrobiota im Wirt während des gesamten Lebens von entscheidender Bedeutung ist, insbesondere bei Aspekten des Alterns, der neurodegenerativen, stoffwechselbedingten Fettleibigkeit und der Darmerkrankung³. So können Perspektiven von GF-Tieren mit längerem Überleben Einblicke in die Mechanismen mikrobieller Rollen bei der Entwicklung und Funktion von Wirtsorganen geben, unter Berücksichtigung des unreifen Immun- und Fortpflanzungssystems von Fischlarven im frühen Leben. Während in früheren Studien Bakterienstämme im Zebrafischdarm isoliert und identifiziert werden konnten, die das Potenzial für die Infektion von GF-Tiermodellen bieten, um Probiotika auszuwählen oder bakterielle Funktionen im Wirt zu erforschen^19,25 war die Generierung und Anwendung von GF-Fischmodellen in erster Linie auf frühe Lebensstadien beschränkt. Diese Einschränkung, die auf den komplexen Produktionsprozess, die hohen Wartungskosten und die damit verbundenen Probleme mit der Nahrung und der Immunität zurückzuführen ist, behindert Forschungsbemühungen, die darauf abzielen, die entwicklungsbedingten und chronischen Auswirkungen der Mikrobiota auf den Wirt zu untersuchen.

Die Überlebensrate, das Verhalten, das Wachstum, die Reifung und die allgemeine Gesundheit von Fischen, insbesondere in keimfreien (GF) Modellen, werden signifikant von den Fütterungspraktiken beeinflusst, die die Nahrungsaufnahme und -absorption während der Zeit des offenen Mundes von den frühen Larven bis zu den Jungtieren umfassen^32,33. Eine der Herausforderungen in der Fischzucht von GF ist jedoch der Mangel an geeignetem sterilem Futter, der die Wirksamkeit der Ernährungsunterstützung zur Aufrechterhaltung des Wachstums und Überlebens der Larven einschränkt. Die Lösung dieses Problems ist entscheidend für die Wiederherstellung des Lebens von GF-Fischen, wenn man ihre entwicklungsfördernden Abwehrmechanismen und ihre schwachen Verdauungsfähigkeiten aufgrund des Fehlens eines Darmmikrobioms berücksichtigt. Was die Ernährung betrifft, so erweist sich die lebende Salinengarnele (Artemia sp.) als die am besten geeignete Nahrung für Larven mit offenem Mund bis hin zu Jungfischen. Es wurde beobachtet, dass Fische, die mit lebenden Salinengarnelen gefüttert werden, höhere Wachstums- und Überlebensraten aufweisen als Fische, die mit gekochtem Eigelb oder anderen natürlichen und synthetischen Ködern gefüttert werden³⁴. Während frühe Lebensmodelle von GF-Fischen mit Dotterunterstützung überleben können und GF-Larvenmodelle durch sterile Fütterung erhalten werden können, bleibt die Generierung von Langzeitmodellen von Larven zu Jungtieren und das Erreichen der Geschlechtsreife eine Herausforderung. Darüber hinaus wird Flocken- oder Pulverfutter durch eine ungleiche Nährstoffzusammensetzung eingeschränkt und kann die Wasserqualität beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu hat lebende Artemia Vorteile wie das Überleben sowohl in Salz- als auch in Süßwasser, die geringe Größe, die für Larven bis hin zu erwachsenen Larven geeignet ist, die einfache Zusammenstellung und eine höhere Schlupfqualität³⁵. Aufbauend auf den vorangegangenen Methoden ^16,24,30 haben wir den komplexen Behandlungsprozess vereinfacht und die Herausforderung der Ernährung angegangen, indem wir leicht inkubierbares GF-Lebend-Artemia sp. als steriles Futter für eine längere Dauer als GF-Fische im frühen Leben etabliert haben.

Diese Studie stellt ein optimiertes Protokoll vor, das (1) die Generation, (2) die Erhaltung, (3) die Identifizierung der Sterilrate und (4) die Erhaltung und Fütterung abdeckt, um das Wachstum von keimfreien (GF) Zebrafischen von den Embryonen bis zu den Larven und Jungtieren sicherzustellen. Die Ergebnisse liefern erste Hinweise auf das Schlüpfen, das Überleben, das Wachstum und die Sterilität von GF Zebrafischen sowie essentielle Indizes für GF Artemia sp. als steriles Futter. Die detaillierten Schritte zur Modellgenerierung und -aufbereitung von sterilem Lebendfutter bieten eine entscheidende technische Unterstützung für die Konstruktion und Anwendung von Langzeitmodellen von GF Fischen sowie von GF Artemia sp. in der Erforschung der Mikrobiota-Wirt-Interaktion. Das Protokoll befasst sich mit der Isolierung, Identifizierung und Infektion von Bakterien an GF-Fischmodellen, skizziert Methoden zur bakteriellen Fluoreszenzmarkierung und zur Beobachtung ihrer Besiedlung im Fischdarm unter einem Mikroskop. GF-Fische, gnotobiotische Fische mit bakterieller Infektion oder übertragene humane Mikrobiota-Modelle werden verschiedenen Detektionen unterzogen, um ihre Funktionen und Auswirkungen auf die Immunität, die Verdauung, das Verhalten, die transkriptomische Regulation und metabolische Aspekte des Wirts aufzuklären. Langfristig kann dieses Protokoll auf verschiedene Wildtyp-Fischarten, wie z. B. marine Medaka, und möglicherweise auf andere ausgewählte transgene Zebrafischlinien ausgeweitet werden, die mit bestimmten Geweben oder Krankheiten korrelieren.