从生肉中检测和分离弯曲 杆菌 属

与本协议相关的所有工作都应在生物安全柜（BSC）内进行，以保持无菌条件，并将样品污染或操作员暴露于微生物病原体的风险降至最低。将样品转移到平衡计分卡外时，请使用密封容器，以防止意外掉落时溢出，保持样品的完整性。优选在整个过程中应使用一次性组件，以减少交叉污染的可能性。如果一次性用品不可行，请确保所有设备和材料在使用前都是无菌的。适当的废物管理至关重要;所有使用过的一次性组件都应作为生物危害废物丢弃。在丢弃材料之前对材料进行高压灭菌，以确保适当的灭菌并避免包含潜在的危险材料。遵守这些预防措施不仅可以保证样品的完整性，还可以最大限度地降低操作人员接触微生物病原体的风险。 图 1 描述了 弯曲杆菌 物种的样品制备、选择性富集、基于过滤器的分离和 mqPCR 分化的工作流程。 补充文件 1 描述了整个过程中更详细的工作流程和图像。 1. 肉类样品的制备 获取肉类样品从当地零售商处购买各种新鲜肉类包装，包括鸡腿、鸡翅、鸡腿和肝脏。 将所有样品转移到4°C的储存中，并在收到后24小时内处理。注意：将新鲜样品储存在较低的温度下，例如低于冰点，会影响回收率。 处理肉类样品遵循FSIS抽样指南6,17中规定的成分比例。 从每个包装中切下 450 克鸡块，并将它们放入胃袋中（见 材料表）。注意： 建议使用胃袋，因为它们具有足够的机械强度来确保下游工艺，并且不会破裂或泄漏。 准备缓冲蛋白胨水（BPW）。将20g粉末（见 材料表）溶解在1L纯化水中。将溶液在121°C高压灭菌15分钟。在无菌水中将溶液稀释至0.1%的浓度。 将 200 mL 0.1% BPW 加入装有鸡肉的胃袋中。 从胃袋外部手动按摩/触诊样品 2 分钟。 使用电动移液器控制器从袋子的过滤侧收集所有鸡肉冲洗液（参见 材料表）。 将鸡肉冲洗液分配到无菌离心机瓶中。在室温下以10,000× g 离心10分钟。 使用带有 25 mL 一次性血清塑料移液器的电动移液器控制器仔细收集上清液。避免干扰颗粒。 根据需要重复该过程以确保除去所有上清液。 弃去收集的上清液。 2. 从生肉中选择性富集弯曲杆菌 用补充剂制备博尔顿肉汤将 13.8 g 粉末（参见 材料表）溶解在 500 mL 纯化水中。通过在121°C下高压灭菌15分钟对肉汤进行灭菌。 将 25 mL 湖化马血（见 材料表）加入灭菌的 500 mL Bolton 肉汤中。注意：添加马血可作为氧淬灭剂，以帮助从食物基质中恢复受伤的 弯曲杆菌 细胞。 在 5 mL 50% 乙醇中复溶 1 瓶抗生素补充剂（头孢哌酮、环己酰亚胺、甲氧苄啶和万古霉素，参见 材料表）。 将复溶的抗生素补充剂添加到博尔顿肉汤中。 浓缩程序将沉淀重悬于含有湖状马血和抗生素的 50 mL Bolton 肉汤中。 将样品（盖子松开）放入密封容器中，该容器保持 85% N2、10% CO2 和 5% O2 的气体混合物。确保盖子松动，但容器密封严密，以产生 弯曲杆菌的微需氧和嗜热生长要求。注意： 当环境室不可用时，可以使用保持 85% N2、10% CO2 和 5% O2 大气的气组。 将样品在42°C孵育24小时。 3.从生鸡肉中分离纯化空肠梭菌和大肠杆菌 布鲁氏菌琼脂平板的制备将28克布鲁氏菌粉（见 材料表）溶于1升纯净水中。将15g琼脂溶解在布鲁氏菌溶液中。 通过在121°C下高压灭菌15分钟灭菌布鲁氏菌琼脂。 在55°C水浴中冷却中等琼脂混合物。 将 20 mL 布鲁氏菌琼脂倒入每个直径为 100 mm 的培养皿中。 过滤方法和菌落培养通过干燥布鲁氏菌琼脂平板，并在生物安全柜中打开盖子0小时，1小时，2小时和3小时，评估水分对弯曲 杆菌 通过过滤器的影响。 通过将 80 μL 样品直接铺在布鲁氏菌琼脂平板上来制备无过滤器对照。 将醋酸纤维素过滤器（0.45μm或0.65孔径，参见 材料表）置于布鲁氏菌琼脂平板的中心。 将 4 滴/过滤器和 20 μL/滴富集样品移液到过滤器上。将液滴放在过滤器中心附近，以确保到达板的液体通过过滤器，而不是过滤器周围。 滴剂的放置方式应确保它们不会扩散和聚集。 将液滴在室温下孵育15分钟，然后小心地取出过滤器。注意：此步骤允许 弯曲杆菌 细胞有足够的时间穿过膜并到达琼脂培养基，而无需过度干燥。 在前面描述的微需氧条件下，在42°C孵育板约24小时。 选择具有特定性状的特征 性弯曲杆菌 菌落。注意： 弯曲杆菌 菌落通常是圆形的，边缘光滑，闪闪发光，呈半透明的淡黄色或粉红色6。 将菌落条纹菌落到布鲁氏菌琼脂平板上进行纯化。重复此步骤，直到获得具有单个均匀菌落形态的平板。 准备长期储存的样品。如前所述准备博尔顿肉汤。从平板中加入一个具有均匀菌落形态的菌落。 在前面描述的微需氧条件下生长过夜（24小时）。将 900 μL 过夜培养物加入含有 100 μL DMSO 的 2 mL 冻存管中。 在干冰 – 乙醇浴（约-72°C）中快速冷却10分钟。转移到-80°C冰箱中长期储存。 4. 空肠梭 菌和 大肠杆菌 物种的鉴定 使用先前开发的多重qPCR（mqPCR）测定法对空肠梭菌和大肠杆菌进行物种水平鉴定18,19。以 96 孔板形式进行快速细胞裂解和基因组 DNA 提取。注意：强烈建议考虑使用商业试剂盒（参见 材料表），以确保样品充分不含已知的PCR抑制剂。将纯化的 弯曲杆菌 菌落分散到100μL提取溶液中。 在99°C下裂解样品10分钟，然后在热循环仪中在20°C下冷却2分钟。 在室温下以8,000× g 离心板10分钟。取出 2 μL 等分试样的上清液用于 mqPCR 测定。 制备一个 20 μL 反应混合物，包括 10 μL 2x 预混液、2.0 μL DNA 样品、104 个内部扩增对照 （IAC） 模板以及 200 nM 的每个引物和探针（参见 材料表）。注： hipO 和 cdtA 的引物和探针分别是 空肠衣原体 和 大肠杆菌的独家靶基因。IAC 由人类腺病毒的 79 bp DNA 片段组成，并作为阳性对照包括在内，以确保 DNA 聚合酶在所有样品中的活性一致。 将所有样品一式三份加载到覆盖有光学薄膜的 96 孔光学板中，并将它们放入实时荧光定量 PCR 系统中（参见 材料表）。在95°C启动DNA聚合酶的热启动激活10分钟。随后在95°C下变性40个循环15秒，在60°C下退火/延伸1分钟。 5. 枚举细胞悬浮液 使用 6 x 6 滴板程序计数细胞悬浮液20.有关描述 6 x 6 滴板方法的图像，请参阅 补充文件 1 。 将布鲁氏菌琼脂平板风干，盖子在层流罩中关闭45分钟。 将 200 μL 细菌悬浮液加入 96 孔板第一列的六行 （A-F） 中。 将 180 μL 布鲁氏菌培养基分布在其余色谱柱的 6 行 （2-12） 中。 使用 20 μL 转印制备 10 倍连续稀释液。例如，将 20 μL 样品从第一列转移到第二列。对至少 6 列重复此过程。 使用移液管将每个悬浮液混合十次，在每次转移之间更换吸头。 使用多通道移液器将来自六行色谱柱的 7 μL液滴沉积在布鲁氏菌琼脂平板表面。 重复此操作以创建一个 6 x 6 数组，确保行是跨列的技术复制。 将板风干5分钟，然后倒置板。将板在42°C孵育24小时。 计算每个代表性稀释中的菌落数。