Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Şekil 1: Bakteriyel klirens testinin şeması. Protokolün ana bölümlerinin grafiksel taslağı (Yukarıdan aşağıya): Bakterilerin hazırlanması, solucan popülasyonunun senkronize edilmesi, 96 oyuklu plakalarda tohumlama, solucanların sterilize edilmesi, ilaç eklenmesi, 1. ve 4. günlerde OD600’ün ölçülmesi. Bu belirli adımların ayrıntılı bir açıklaması, her tasvirin solunda belirtilmiştir. Kısaltmalar: OD = optik yoğunluk; FUdR = florodeoksiüridin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. Bakteri hazırlama NOT: Bu bölüm, bu tahlilde kullanılan besleme bakterilerinin hazırlanmasını detaylandırır. Testte kullanılan spesifik E. coli suşu OP50 olarak adlandırılır. OP50, C. elegans’ı beslemek için en yaygın kullanılan türdür. Kullanılan OP50 suşu, solucan kültürünün diğer bakterilerle çapraz kontaminasyonunu önleyen Karbenisilin/Ampisilin’e dirençlidir9. OP50’yi 4-5 gün önceden hazırlayın ve kullanımdan bir gün önce röntgen ışınlayın. OP50 ile karşılaşan tüm malzemelerin steril olduğundan emin olun29,30. Gün -8: Çarşamba (1. hafta):5 mL LB’yi 100 μg/mL Ampisilin ve 0.1 μg/mL Amfoterisin B ve tek bir OP50 kolonisi ile aşılayarak preinokülumu hazırlayın ve bir bakteri çalkalayıcıda 37 ° C’de yaklaşık 6 saat inkübe edin. Kültürün bulanıklaşması için yeterli büyümeye izin vermek için erken aşılayın. Kültür bulanıklaştığında, OP50’nin preinokülum kültürünü 100 μg / mL Ampisilin içeren 250 mL TB içinde 1: 2.000 oranında seyreltin. Kültürü gece boyunca bir bakteri çalkalayıcıda 37 ° C’de 17-19 saat inkübe edin.NOT: Kültürün 19 saatten daha uzun süre büyümesine izin verilmemelidir. Gün -7: Perşembe (1. hafta)17-19 saatlik inkübasyondan sonra, OP50 sıvı kültürünü steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C’de bir masa üstü santrifüjde 3.100 × g’da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, OP50 peletini steril suyla yeniden süspanse edin ve yeniden santrifüjleyin. Bu yıkamayı 2 kez tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı atın, OP50 peletini steril suda 50 mL’lik bir hacme kadar yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın. OP50’yi 4 °C’de bir masa üstü santrifüjde 3.100 × g’da 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüpte su kalmadığından emin olun. Boş santrifüj tüpünün ağırlığını pelet ile santrifüjleme tüpünün ağırlığından çıkararak peletin ağırlığını hesaplayın.NOT: Pelet ağırlıkları tipik olarak 3-3,5 g arasında değişir. OP50 peletini S-tam tampon içinde 100 mg / mL’lik bir konsantrasyona iyice yeniden süspanse edin ve topak olmadığından emin olun. 100 mg / mL’deki OP50 konsantrasyonunun 2 × 1010 bakteri / mL’ye karşılık geldiğinden emin olun. Optik yoğunluk ile mL başına bakteri sayısı arasındaki ilişki biliniyorsa, mL başına bakteri konsantrasyonunu spektrofotometrik olarak belirleyin. Gerekirse, OP50 besleme çözeltisinin konsantrasyonunu 2 × 1010 bakteri / mL’ye ayarlamak için S-tam tampon kullanın. Kontamine olup olmadığını belirlemek için OP50’yi bir agar plakası üzerinde test edin. OP50’yi 4 °C’de S-tam tamponda asılı olarak saklayın. Gün -3: Pazartesi (2. hafta)Test sırasında bakteri üremesini önlemek için bakterileri X-ışını ışınlaması yoluyla öldürün. 2. Senkron solucan kültürü hazırlama NOT: Bu bölümde, senkron bir solucan popülasyonunun hazırlanması anlatılmaktadır. Solucan popülasyonları ile temas eden tüm materyaller sterildir. Aksi belirtilmedikçe tüm plakalar 20 °C’de tutulur. Gün -6: Cuma (1. hafta), 16:00Hayvanları taze bir tabağa aktarın.Solucan popülasyonunun çoğunun aç L1 larvalarından oluştuğu bir NGM plakası alın.NOT: Karışık bir popülasyon da sonuç verecektir. Uzun süre aç bırakılan L1 solucanlarının kullanılması, mevcut veya gelecek nesillerdeki beslenme davranışını etkileyebilir, çünkü açlık en az üç nesil boyunca epigenetik izler bırakabilir. Solucanları 1 mL’den fazla steril su ile yıkayın. Yıkanmış solucan popülasyonunun ~ 300 μL’sini konsantre OP50 (~ 300 mg / mL) ile tohumlanmış NGM plakalarına alıkoyun. Plakaların bir plaka kurutucu veya bir Bunsen brülörü altında kurumasına izin verin. Plakaları 20 ° C’de, popülasyonun çoğu gravid yetişkinleri içerene kadar (Pazartesi) kuluçkaya yatırın.NOT: Bu zaman dilimi, vahşi tip bir N2 solucan popülasyonu için optimize edilmiştir ve suştan türe değişebilir. Gelişme gecikmeleri olan solucanlar dikkate alınmalı ve daha erken parçalanmalı ve/veya daha erken tohumlanmalıdır, böylece test edilen tüm suşlar aynı anda yetişkinliğe ulaşacaktır. Gün -3: Pazartesi (2. hafta) 10:00Eşzamanlı bir popülasyon oluşturmaDİKKAT! Çamaşır suyu cilt ve gözler için aşındırıcıdır. Kullanımı eldiven ve koruyucu gözlük gerektirir.Solucanları plakadan 10 mL’ye kadar steril su ile yıkayarak toplayın. Bu solucan / su çözeltisini 15 mL’lik konik bir tüpe aktarın. Solucanları yaklaşık 4 dakika boyunca tezgah üstünde yerçekimi lavabosu ile yıkayın (tersine, 310 × g’da bir masa üstü santrifüjde 2 dakika santrifüjle yıkayın. Süpernatanı küçük bir uç kullanarak aspirasyon yoluyla atın ve 15 mL’ye kadar steril su ekleyin. 3x tekrarlayın. Süpernatanı çıkarın ve 5 mL taze hazırlanmış çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (1.8 mL ev tipi çamaşır suyu, 0.5 mL 10 N NaOH, 7.7 mL dH2O) ekleyin. Oda sıcaklığında veya solucanlar açılana kadar 5 dakika inkübe edin. En az 10 saniye boyunca her dakika nazikçe girdap yapın. Diseksiyon mikroskobu altında ilerlemeyi izleyin.NOT: Solucanları kırmak için gereken süre suştan suşa değişebilir. Solucanları çamaşır suyu solüsyonunda çok uzun süre bırakmak, cansız yumurtalara neden olabilir. Tüm yetişkinler açıldığında veya çözündüğünde (son hacim 15 mL olacak) reaksiyonu nötralize etmek için M9 tamponu ekleyin ve 1.300 × g’da 2 dakika santrifüjleyin. Yumurtaları 3 kez 13 mL M9 tamponu ile yıkayın. Yumurtaları 1.300 × g’da 2 dakika santrifüj ederek 10 mL S-tam tampon ile bir kez yıkayın. Süpernatanı aspire edin, 10 mL S-complete ekleyin ve süspansiyonu 15 mL’lik yeni bir konik tüpe aktarın. Tüpü gece boyunca bir nutatör veya benzeri bir cihaz üzerinde oda sıcaklığında yavaşça döndürün. İsteğe bağlı: S-tam tamponda son santrifüjlemeden sonra yetişkin karkaslar mevcutsa, solucan çözeltisini 40 μm’lik bir hücre süzgecinden süzün. Gün -2: Salı (2. hafta), 13:00Hayvanları tabaklara tohumlamakBir diseksiyon kapsamı kullanarak, solucanların yumurtadan çıkıp çıkmadığını kontrol edin. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak solucan popülasyonunu 10 μL’lik damlalar halinde sayarak S-tam tamponundaki solucan konsantrasyonunu belirleyin; Her numune için 5-10 damla sayın. Her 10 μL’lik damladaki solucan konsantrasyonu damla başına 30 solucanı aşarsa, saymayı kolaylaştırmak için toplam stoğu S-complete ile damla başına daha düşük bir solucan yoğunluğuna seyreltin. Sıvı solucan karışımını, 120 μL’lik bir hacimde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aşağıdaki gibi tohumlayın (nihai konsantrasyonlar): S-tam içinde 60 solucan / mL, 50 μg / mL Karbenisilin, 0.1 μg / mL Amfoterisin ve 6 mg / mL OP50 bölüm 1’de hazırlanan.NOT: Hazırlanacak toplam hacim plaka sayısına bağlıdır (96 oyuklu plaka başına ~ 12 mL). Her oyukta 6-12 solucan bulunmalıdır. Alternatif olarak, Union Biometrica’nın COPAS FP’si gibi büyük bir partikül akış sitometrisi, her bir kuyucuğa 10 solucanı hassas bir şekilde ayırmak için kullanılabilir (Bkz. kalabalık etkisi bölümü). Ayrıca solucan içermeyen bir sıvı karışımı da içerir: 50 μg/mL Karbenisilin, 0.1 μg/mL Amfoterisin ve 6 mg/mL OP50 bölüm 1’de hazırlanır. Daha önce de belirtildiği gibi, kendi kendine değerlerini belirlemek için kullanılan 96 oyuklu plakanın H sırasına 120 μL solucansız karışım koyun. AG sıralarında solucanlar ile karışımın oyuğuna 120 μL koyun.NOT: Pipetleme sırasında solucanların süspansiyon halinde tutulduğundan emin olun (bkz. Şekil 2A, B). Düz tabanlı şeffaf 96 oyuklu plakalar kullanıyoruz. Plaka düzenimiz, her bir sütun çiftinin farklı bir ilaç tedavisi veya solucan suşu olacağı ve alt sıranın “solucan yok” kontrolü olarak hizmet edeceği 4 veya 6 koşul üretmek için plakayı böler (Şekil 2A, B). Kirlenmeyi ve buharlaşmayı önlemek için plakayı bir bant kapatıcı ile kapatın. Plakaları, hayvanlar L4 solucanı haline gelene kadar 20 ° C’de yaklaşık 65 saat kuluçkaya yatırın. 0. Gün: Perşembe (2. hafta) öğleden önce.Florodeoksiüridin (FUdR) ilavesiyle solucan popülasyonunun sterilizasyonu.Her oyuktaki hayvanları sterilize etmek için 30 μL 0.6 mM FUdR stok çözeltisi ekleyin. Bant kapatıcılar kullanarak plakayı yeniden kapatın ve plakaları 800 rpm’de bir mikro titre plaka çalkalayıcı üzerinde 20 dakika sallayın. Plakaları 20 °C inkübatöre geri koyun.NOT: Bu adımda, nihai OP50 konsantrasyonu 6 mg / mL’den 5 mg / mL’ye (1 × 109 bakteri / mL) düşürülür ve her bir kuyucuğun nihai hacmi 150 μL’dir. Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan önce FUdR’yi L4 aşamasına eklemek çok önemlidir. 1. Gün: Cuma (2. hafta)Kültüre ilaç ekleyin.Sabah 9:00’a kadar, çoğu hayvanın gravid olduğunu ve her oyuğun birkaç yumurta içerdiğini onaylayın. Gerekirse, istenen konsantrasyona herhangi bir ilaç ekleyin (tartışmaya bakın). İlacı ekledikten sonra, plakaları bant kapatıcı ile kapatın ve plakaları bir plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm’de 20 dakika çalkalayın.NOT: Çalkalama, tüm bakteri kümelerinin sızdırmazlık maddesine dokunmadan çözülmesini sağlar. Sızdırmazlık maddesi üzerindeki hem bakteri kümeleri hem de sıvı OD600 okumasını bozacaktır. Sızdırmazlık maddesinin üzerinde sıvı damlaları varsa, 310 × g’da 10-20 saniye kısaca döndürün. Çalkalayıcı üzerinde tekrar 5 dakika çalkalayın ve ölçün. Mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 20 dakika çalkaladıktan sonra, kapağı ve contayı çıkarın ve OD600’ü bir plaka okuyucuda ölçün; bu, Gün 1 OD600 ölçümüdür. Plakaları kapatın ve 20 °C’lik bir inkübatöre geri koyun.NOT: Bakteriler hızlı bir şekilde yerleştiğinden, okuma plakaları salladıktan sonra 10 dakika içinde yapılmalıdır. Bir ilaç eklenmişse, solucan popülasyonunu kontaminasyon veya toksisite belirtileri açısından kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Plakaları 20 °C inkübatöre geri koyun. 4. Gün: Pazartesi (3. hafta)Gün 4 OD600 okumasını alın.Gün 1 OD 2.5.1.3 değerini elde etmek için 4 . günden (600 . adım) itibaren okuma prosedürünü tekrarlayın. OD600 ölçümünden önce, plakaları mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm’de 20 dakika çalkalayın. Ters çevrilmiş bir mikroskopta, ideal olarak 2x objektifle, her bir oyuktaki solucan popülasyonunu sayın ve bir elektronik tabloya kaydedin. Plakaları saydıktan sonra 20 °C inkübatöre geri koyun.NOT: Ek Materyal’de sağlanan puanlama sayfamızın bir örneğine bakın. 4. Gün okumasından sonra, gıda alımı ölçümleri tamamlanır. Gerekirse, bu plakaları kullanım ömrü analizi için saklayın.NOT: Bu protokol Solis ve Petrascheck31 ile uyumludur. 3. Gıda alım verilerinin analizi Şekil 2: Tasarım ve analiz. (A, B) H satırında “solucansız” kontrol kuyuları ile 4 ve 6 koşulları için olası plaka tasarımları. Bu kuyular kendi kendine analiz oranını belirlemek için gereklidir. Her plakada, referans olarak her zaman bir N2 işlenmemiş kontrol popülasyonu ekleyin. (C) Sağlanan elektronik tabloda solucan sayısı (yeşil kutu), 1. ve 4. günlerdeki iki OD600 ölçümü (turuncu kutular), kendi kendine analiz değerleri (mavi kutu) ve kırmızı kutuda formül (2) ((OD600 -kendi kendine analiz)/X0) kullanılarak yapılan değerlendirme ile toplanan örnek veriler. Burada gösterilen özel örnek, (B)’de gösterilen plaka tasarımını kullanır. Kısaltmalar: OD = optik yoğunluk; X0 = kuyucuk başına solucan sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Bu bölüm, bu protokolün 2. bölümündeki gıda alımı verilerinin nasıl analiz edildiğini açıklamaktadır. Hesaplanacak ilk değerler kendi kendine kontrol değerleridir. Bakteriler, solucanların yokluğunda bile zamanla sıvı içinde parçalanır. Bu selflysis değeri de birçok kimyasaldan etkilenebilir ve bir solucanın besin alımına kıyasla nispeten büyük olduğu için kontrol edilmesi gerekir. Adım 2.3.1.4’te açıklandığı ve Şekil 2A, B’deki plaka düzeninde gösterildiği gibi, H satırı solucanlar hariç aynı çözeltiyi içerir. Şekil 2B’de gösterilen plaka kurulumumuzda, iki ilgili kendi kendine kontrol kuyusu ile koşul başına 14 kuyu vardır (satır H, “solucan yok”). Denklem (1) kullanarak her koşulda solucansız kontrol kuyuları için kendi kendine kontrol değerlerini hesaplayın. Her bir çoğaltma kuyusu grubu için, adım 2.3.1.4’te belirtildiği gibi en az iki solucansız kontrol kuyusu olduğundan emin olun. Bir çoğaltma grubu için özanaliz değeri için tüm solucansız kontrol kuyularından gelen ortalamayı kullanın.Selfysis = ortalama(OD600 Gün 1 – OD600 Gün 4) (1)NOT: Şekil 2B’de gösterilen plaka kurulumu için, H satırındaki iki kendi kendine kontrol kuyusunun ortalamasını hesaplayarak, altı grubun her biri için bir tane olmak üzere altı özsellik değerini hesaplayacağız. Denklemi kullanarak solucan başına gıda alımını hesaplayın     (2).NOT: Elektronik tabloda kullanılan formül (kırmızı kutu, Şekil 2C) ve X0 kuyucuk başına solucan sayısıdır. Her kuyucuk için solucan başına gıda alımı belirlendikten sonra, tüm durum için ortalamaları ve standart sapmayı hesaplayın.NOT: Şekil 2B’de gösterilen plaka kurulumu için, istatistiksel karşılaştırmalar için koşul başına 14 çoğaltma kuyusu yeterlidir. Her koşulu ilgili N2 işlenmemiş kontrol popülasyonuna normalleştirin. Beslemedeki değişikliği kat değişikliği veya N2 beslemesinin yüzdesi olarak belirtin.NOT: Denklem (2)’deki OD600/X0’ın mutlak değerleri farklı günlerde yapılan deneyler arasında farklılık gösterebileceğinden normalleştirme yapılır.