예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화
Summary
이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.
Abstract
섭식은 유기체의 성장, 번식 및 생존에 필수적인 생물학적 과정입니다. 이 분석은 노화 또는 신진대사의 유전학을 연구할 때 중요한 매개변수인 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 식품 섭취량을 측정하는 것을 목표로 합니다. 대부분의 종에서 먹이는 제공된 먹이의 양과 주어진 시간 간격 후에 남은 양 사이의 차이를 측정하여 결정됩니다. 여기에 제시된 방법은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 먹이를 결정하기 위해 동일한 전략을 사용합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 먹이 공급원인 박테리아의 양을 측정하여 72시간 이내에 제거합니다. 이 방법은 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하며, 다른 동물 모델에서는 불가능한 속도와 깊이로 식품 섭취를 조절하는 능력에 대해 수백 가지 약물을 스크리닝할 수 있었습니다. 이 분석법의 강점은 먹이와 수명을 동시에 측정하고 먹이의 소실을 직접 측정할 수 있으므로 다른 유기체에 사용되는 것과 동일한 원리를 기반으로 하여 종 간 비교를 용이하게 한다는 것입니다.
Introduction
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 노화 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 이는 식이 제한, 미토콘드리아 활동 감소 또는 인슐린 신호 감소에 의해 유도되는 대사 매개 장수의 기저에 있는 유전학을 연구하는 강력한 모델이었습니다. 1,2,3,4,5,6,7입니다. 그러나 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 3,8,9,10,11,12,13,14,15라는 작은 크기로 인해 수명의 맥락에서 먹이를 측정하는 것이 어렵다는 것이 입증되었습니다.
섭식은 생존에 필요한 기본적인 생물학적 행동이며, 엄격한 조절은 신진대사 건강, 생식 및 노화 유지의 핵심입니다. 섭식 행동은 신경계와 말초의 여러 신호 전달 경로에 의해 제어되므로 생체 내 16,17,18,19 만 연구 할 수 있습니다. 섭식은 유기체의 에너지 항상성을 관장하는 (i) 에너지 섭취, (ii) 에너지 저장, (iii) 에너지 소비의 세 가지 기둥 중 첫 번째를 나타냅니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 섭식은 주로 인두의 수축 속도에 의해 정의되는 인두 펌핑을 측정하여 조사되었습니다. 이 접근법은 예쁜꼬마선충의 섭식 행동에 대한 중요한 통찰력을 제공했다 3,4,8,12,13,20,21; 그러나 특히 짧은 분 간격으로 측정된 인두 펌핑이 반드시 음식 섭취와 관련이 있는 것은 아닙니다.
음식 섭취는 인두 펌핑 속도뿐만 아니라 먹이 시합 지속 시간과 빈도, 음식 박테리아의 밀도와 같은 매개 변수에 의해서도 결정됩니다. 동물은 매우 높은 인두 펌핑을 가질 수 있지만 먹이를 먹는 시간이 더 짧아서 증가된 속도를 상쇄할 수 있습니다. 또 다른 혼란스러운 요인은 펌핑이 박테리아를 섭취하고 분쇄하지 않을 수 있는 효율성입니다. 인두 펌핑에서 음식 섭취를 분리하는 극단적인 예는 음식물(박테리아)이 없는 상태에서 세로토닌을 추가하는 것입니다. 외인성 세로토닌이 있는 상태에서 동물은 높은 속도로 펌프질을 하지만 박테리아가 없으면 높은 펌핑 속도가 음식 섭취로 이어지지 않습니다 2,6,13,22,23.
여기에 제시된 박테리아 제거 방법은 시간이 지남에 따라 박테리아 농도가 감소함에 따라 개별 우물에서 지렁이 개체군의 먹이 섭취량을 측정합니다(그림 1). 이 접근법은 먹이의 소멸이 음식 섭취량의 척도를 나타내는 다른 종에서 사용되는 것과 유사합니다 10,11,24,25,26,27,28. 원래 간행물에서 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에게 15N동위원소 표지 박테리아를 먹이어 음식 섭취량을 측정하는 이 방법을 검증했습니다11. 질량 분석법에 의한 후속 측정은 박테리아의 소멸을 측정하는 것이 동위원소 표지의 발생과 강한 상관 관계가 있음을 보여주었으며, 박테리아가 동물에 실제로 흡수되었음을 드러냈다11. 따라서 우리는 박테리아 제거 분석이 대부분의 상황에서 식품 섭취를 나타낸다고 확신합니다. 이 분석의 목적은 인두 펌핑 분석을 대체하는 것이 아니라 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 섭식 및 신진대사와 노화 및 수명과의 관계를 연구하기 위해 분석 도구 상자에 추가하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 예쁜꼬마선충(C. elegans) 식품 섭취에 대한 판독값으로 박테리아 제거율을 측정합니다. 대표 결과 섹션의 용량-반응 곡선은 분석이 식품 섭취량을 정량적으로 측정한다는 것을 보여주며, 이는 동위원소 표지 박테리아11을 사용하여 독립적으로 확인된 개념입니다. 이 분석을 사용하여 알려진 인간 대사 부작용이 있는 항정신병 약물과 같은 FDA 승인 약물을 성공적으로 테스트했으며 이러한 약물이 예쁜꼬마선충10,26에서 섭식을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 분석은 섭식의 유전학 또는 약리학을 연구하는 데 유용하며 신진대사를 연구하기 위한 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구를 위한 새로운 도구를 추가합니다. 이 분석법은 대부분의 다른 유기체에서는 불가능한 확장 가능하고 시간 친화적인 방식으로 섭식을 연구할 수 있는 저비용 방법을 제공합니다. FDA 승인 약물에 대한 우리의 연구는 인간 환자에서 볼 수 있는 많은 부작용이 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서도 관찰됨을 보여주며, 이는 진화론적 보존(evolutionary conservation)을 보여준다 24,26,32.
이 분석은 OD600 측정의 선형 범위 내에서 측정할 수 있는 박테리아의 농도에 의해 제한됩니다. 결과적으로 웜의 수와 분석할 수 있는 박테리아 농도 범위가 제한됩니다. 웜이 너무 많으면 박테리아를 너무 빨리 섭취하여 OD600 에 영향을 미치므로 선형 OD600에서 박테리아 농도를 “먹어치게” 됩니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 박테리아 준비의 가변성은 실험마다 결과가 달라지는 중요한 매개 변수입니다. 우리는 많은 양의 박테리아를 얼리거나 동결 건조된 박테리아를 사용하려고 시도했지만 실패했습니다. 이러한 경우, 자가 분해 속도가 너무 높았거나 박테리아가 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 발달을 늦출 수 있는 품질이었습니다. 그러나 우리의 테스트는 철저하지 않았으므로 이 문제는 해결할 수 있을 수 있습니다.
일반적으로 박테리아의 자가 분해 속도는 제어하기가 가장 까다로우며 상당한 변동성을 유발할 수 있습니다. 우리는 일부 약물이 분석이 식품 섭취량을 확실하게 결정할 수 없는 수준까지 자가 분해율을 증가시킬 수 있음을 발견했습니다. 분석에서 자가 분해 율은 시간이 지남에 따라 증가하기 때문에 성인이 된 지 5일 이후에는 음식 섭취량을 측정하지 않았습니다. 그 나이가 되면 박테리아는 배양 상태에서 ~10일 동안 지속됩니다. 성충 5일 이후의 음식 섭취량을 측정하려면 오래된 박테리아를 씻어내고 새로운 박테리아로 교체해야 합니다.
제시된 분석은 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 수명 분석(31)의 확장입니다. 이 조합을 통해 동일한 개체군의 수명과 음식 섭취량을 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 세균 제거 분석은 세균 자가 분해로 인해 예쁜꼬마선충의 전체 생애에 걸친 음식 섭취량을 결정할 수 없지만, 가장 많은 음식 섭취량을 가진 시기인 성체의 첫 4일에 대한 확실한 데이터를 제공합니다. 특히 저분자 신약 개발의 경우 식품 섭취를 통제하는 것이 필수적입니다. 요약하면, 우리는 제시된 분석이 예쁜꼬마선충 커뮤니티에 유용할 것으로 예상하고 노화 및 수명 연구의 맥락에서 대사를 연구하거나 제어하기 위한 도구 세트를 확장할 것으로 기대합니다.
계획:
음식 섭취량을 측정하기 전에 몇 가지 사항을 고려해야 합니다.
박테리아 죽이기:
50mL 원뿔형 튜브(160.0kV 및 25.0mA에서 설정된 4시간 동안 900 회색)에 X선을 조사하여 박테리아를 죽입니다. 우리는 방사선 조사를 위해 Rad Source의 RS2000을 사용합니다. 장비에 따라 구체적인 시간과 방사선량은 시설마다 다를 수 있습니다. 박테리아의 완전한 사멸은 성장에 의한 생존자를 감지하기 위해 방사선 조사 후 박테리아를 도금하여 결정해야 합니다. 분석 중 성장을 방지하기 위해 모든 박테리아를 죽이는 것이 필수적이며, 이는 먹이를 과소 평가하거나 심지어 부정적인 먹이 값을 유발할 수 있습니다. 중요한 것은 예쁜꼬마선충(C. elegans)이 여전히 박테리아를 먹을 수 있도록 박테리아를 죽여야 한다는 것입니다. 우리의 경험에 따르면 많은 양의 박테리아를 안정적으로 죽이는 세 가지 방법이 있습니다 : (i) X 선에 의한 조사, (ii) γ선에 의한 조사, (iii) 포름 알데히드29,30의 첨가. 이 세 가지 방법 간의 자기 분해 비율은 비슷하며, 그림 3B에 표시된 실험에 대한 자기 분해 속도 간의 변동 계수는 8%입니다. 우리 손에서 확실하게 작동하지 않는 방법은 UV 조사, 항생제 칵테일, 열 비활성화 및 아지드 나트륨이었습니다. 이러한 방법은 박테리아를 완전히 죽이지 못하거나(UV 및 항생제), 예쁜꼬마선충이 먹지 않는 박테리아를 생성하거나(열), 음식 섭취량을 변화시킵니다(아지드화나트륨).
반복실험 횟수:
우리의 경험에 비추어 볼 때, 수유의 접힘 변화는 일반적으로 관찰된 변동에 비해 작습니다. 따라서 음식 섭취량의 변화를 측정하려면 여러 번의 반복 우물이 필요합니다. 그림 2A, B는 21개 또는 14개의 복제 웰과 웜이 없는 2개의 자가 분해 제어 웰이 있는 4개 또는 6개의 서로 다른 조건에 맞게 설계된 96웰 플레이트를 보여줍니다. 큰 변동성과 예상되는 상대적으로 작은 변화를 감안할 때 섭식의 0.5-2.5 배 변화가 하한과 상한이 되는 경향이 있습니다. 각 조건에 대해 14-21개의 반복 웰과 다음에 설명된 최소 2개의 자기 분해 제어 웰을 권장합니다. 이러한 반복실험은 섭식을 변경하는 약물에 대한 정량적 용량-반응 곡선을 생성하기에 충분합니다11,26.
자가 분해 제어:
OD600 은 대부분 입자 크기와 무관하게 용액 내 입자의 수를 측정합니다. 그러나 죽은 박테리아는 용해되어 입자 특성을 잃게 됩니다. 우리는 이것을 자기 분해라고 부르며, 이는 웜이 있는 곳에서 독립적으로 발생하며 웜이 먹지 않고 OD600 측정값을 낮춥니다. 자가 분해는 분석 중에 발생하며 조건당 최소 2개의 웰에서 독립적으로 측정해야 합니다. 이 우물은 벌레가 없다는 점을 제외하고는 동일한 조건 내의 다른 우물과 동일한 처리를받습니다. 우리는 많은 약물이 자가 분해 속도도 변화시킬 수 있다는 것을 발견했습니다. 따라서 각 조건에는 각각의 농도를 가진 독립적인 자기 분해 제어 웰이 필요합니다. 그림 2 는 4개 또는 6개의 조건에 대한 플레이트 설정을 보여주며, 모든 자가 분해 제어 웰이 행 H의 플레이트 하단에 있습니다.
N2 참조 모집단:
우리는 또한 소비된 박테리아의 절대적인 양이 실험 간에 변동될 수 있으며, 이는 박테리아의 품질과 관련이 있을 가능성이 높다는 점에 주목했습니다. 매번 정확히 같은 방식으로 준비하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 변동이 있습니다. 예를 들어, 박테리아는 로그 성장 단계에서 분열 상태에서 수확할 수 있으므로 고정 단계에서 수확된 박테리아보다 크기가 훨씬 큽니다. 따라서 박테리아 크기의 이러한 단순한 차이는 OD600 측정이 크기를 구분하지 않기 때문에 소비되는 박테리아 수와 다른 OD600 값의 변화로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, 실험 그룹이 N2 대조군보다 더 많이 또는 더 적게 먹는지 확인하기 위해 1 또는 100%로 설정된 참조 값으로 사용되는 처리되지 않은 N2 대조군 동물 한 마리를 항상 포함합니다. 이 방법을 사용하면 OD600 값이 달라지더라도 실험 간의 비교가 가능합니다.
시간 간격:
OD600 값을 사용하여 음식 섭취량을 측정하려면 박테리아 농도가 눈에 띄게 감소해야 합니다. 배양량이 벌레보다 훨씬 크기 때문에 감지 가능한 차이를 만들기 위해 상당한 양의 박테리아를 먹어야 합니다. OD600 값에 대한 선형 범위를 유지하려면 박테리아 농도가 ~1mg/mL에서 10mg/mL 사이로 유지되어야 하므로 이를 검출하기 위해 상당한 양의 박테리아가 사라져야 합니다. 지렁이는 알을 낳기 때문에 L4 후반부터 성충 4일까지 가장 많이 먹습니다. 따라서 이 간격이 이상적입니다. 24 h와 같은 더 짧은 간격은11 번 측정 할 수 있지만 이는 훨씬 더 어렵고 조건 당 ~ 40 웰이 필요합니다. 유충의 먹이 섭취량을 측정하는 또 다른 옵션은 우물당 동물의 수를 두 배로 늘리는 것입니다. 그러나 이 접근 방식의 문제점은 너무 많은 웜이 자랄 때 OD600 판독값에 영향을 미치기 시작한다는 것입니다.
테스트할 약물에 대한 스톡 솔루션:
세로토닌과 같은 약물이 섭식 조절 능력을 테스트하는 경우 스톡 용액을 준비할 때 다음 사항을 고려하십시오. 일반적으로 수용성 약물을 위해 50x 스톡을 준비하고 각 웰(1:50)에 3μL를 추가하지만 다른 스톡 농도(100x, 300x)도 사용할 수 있습니다. 그러나 약물을 물 이외의 용매(예: DMSO)에 희석하는 경우 최종 농도는 0.5%를 초과해서는 안 됩니다. 용제는 C. elegans에 빠르게 해로워집니다. 따라서 DMSO와 같은 유기용매에 용해된 약물의 원액은 300배 이상이어야 합니다.
살아있는 웜과 죽은 웜 점수 매기기:
살아있는 동물과 죽은 동물의 결정은 벌레의 움직임을 기반으로 합니다. 강한 빛, 특히 청색광은 동물을 움직이게 하기 때문에 사용됩니다. 또한 우물당 동물 수를 점수화하면 초과 사망이 있는지 알 수 있습니다. 독성 물질 또는 DMSO를 포함한 여러 용매의 고농도(>0.5%)로 인해 초과 사망이 발생할 수 있습니다. 일반적으로 죽은 동물은 1:100(1%) 미만이어야 합니다. 음식이 가라앉고 개체수를 계산하기 어려워지면 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 800rpm으로 30초 동안 플레이트를 흔들 수 있습니다. 수컷 또는 16 마리 이상의 벌레가있는 우물은 무시하십시오 (문제 참조).
발생할 수 있는 문제:
부적절한 쉐이킹:
액체 매체에서 박테리아는 쉽게 뭉쳐 우물 바닥에 침전할 수 있습니다. 경험에 비추어 볼 때 20분 미만으로 흔들면 박테리아 덩어리가 분해되지 않고 부유하지 않아 부정확한 OD600 측정이 발생할 수 있습니다. 박테리아 덩어리가 있는 상태에서 OD600 측정은 박테리아 농도를 과소 평가합니다. 과도한 쉐이커 설정으로 인해 액체가 실러에 달라붙을 수 있습니다. OD600 판독을 위해 실러를 제거하면 실러에 붙은 액체로 인해 OD600 판독값이 낮아집니다. 씰러에 액체가 있으면 플레이트를 저속(500-1,000rpm)으로 빠르게 돌리고 다시 5분 동안 흔듭니다. 또한 1일 차와 4일 차의 판독값에 대해 명시된 대로 박테리아가 침전되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 흔든 후 10분 이내에 판독해야 합니다.
실험 간 다양한 절대 음식 섭취량:
박테리아 제제를 표준화하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 지렁이의 먹이 섭취에 영향을 미치는 방식으로 차이가 있는 경우가 많습니다. 예를 들어, 분열 상태로 인해 박테리아는 로그 성장 단계에서 수확되었는지 고정 단계에서 수확되었는지 여부에 따라 크기가 다르며 로그 박테리아가 더 큽니다. OD600 측정은 크기를 구분하지 않기 때문에 박테리아를 수확한 단계로 인한 박테리아 크기의 차이로 인해 박테리아 제제 간의 기초 식품 섭취에서 관찰된 명백한 차이가 발생할 수 있습니다. 실험 간에 비교하는 가장 좋은 방법은 항상 처리되지 않은 N2 대조군 모집단을 포함하고 결과를 이 N2 모집단으로 정규화하는 것입니다.
군집 효과:
이 프로토콜의 박테리아 농도는 OD600을 ~ 72 시간 동안 웰 당 2-16 개의 웜에 대한 선형 범위로 유지하기에 충분합니다. 관심 약물에 따라 16마리 이상의 벌레가 있는 우물은 두 번째 측정 전에 박테리아 농도를 고갈시킬 수 있습니다. 우리는 또한 한 마리의 동물이 있는 우물은 신뢰할 수 없는 경향이 있다는 것을 발견했습니다. 용해 인자는 지렁이 한 마리가 먹는 것보다 더 큽니다. 따라서 lysis factor를 결정하는 데 있어 사소한 오류는 웜이 더 적은 우물에 불균형적으로 영향을 미칩니다.
아래 조건 중 하나가 충족되는 경우 통계 분석에서 웰을 제외하는 것이 좋습니다. 우물 안에는 수컷이 있습니다(수컷과 자웅동체 사이의 음식 섭취량을 비교하는 데이터는 없습니다). 우물에 벌레가 2마리 미만이거나 우물에 16마리 이상의 벌레가 있습니다. 벌레는 두 번째 판독에서 죽습니다. 또는 FUdR이 실패했기 때문에 우물에 자손이 있는 경우. FUdR은 열에 민감하며 37°C의 낮은 온도에서도 비활성화됩니다. FUdR은 항상 실온의 물에서 해동하십시오.
음의 음식 섭취량:
음식 섭취량 값은 때때로 음수이며, 이는 1일차보다 4일차에 더 많은 음식을 암시합니다. 음의 음식 섭취 값은 다음 요인 중 하나를 나타낼 수 있습니다 : 박테리아에 작용하는 약물이 첨가되어 발생할 수있는 높은 자기 분해 율 또는 우물이 오염되어 벌레가 아닌 다른 것이 자라고 있음을 암시 할 수있는 음의 음식 섭취 값. 자가 분해 율은 박테리아가 나이가 들면서 증가합니다. 따라서 일주일 이상 된 박테리아는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 시간이 지남에 따라 침전되는 약물이 추가되어 OD600 값에 영향을 미칩니다. 1일차에 흔들림이 충분하지 않으면 박테리아 덩어리로 인해 OD600 판독값이 낮아질 수 있습니다. 지렁이는 저산소 스트레스를 받았습니다. 이것은 표면 대 공기 비율이 산소 교환을 허용하기에 충분하지 않을 때 발생합니다. 재료에 특정 96웰 플레이트를 사용하고 웰당 150μL(120μL + FUdR 30μL)를 초과 하지 마십시오 . 우물 표면과 지렁이가 사는 바닥 사이의 거리에 따라 산소 농도가 결정됩니다.
제한:
이 분석은 액체 배양으로 제한됩니다. 단단한 접시에서 관찰된 먹이 거동(예: 식품 잔디밭 안팎으로 움직이는 것)은 분석으로 평가할 수 없습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Xiaolan Ye에게 감사하고 싶은데, 이 프로토콜은 그녀가 원래 한 관찰의 결과로 개발되었기 때문입니다. 이 프로토콜의 개발 및 최적화에 도움을 주신 Petrascheck Lab의 모든 과거 및 현재 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 R21 AG080376(MP에게)의 자금 지원을 받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)의 자금 지원을 받는 CGC에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
| Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
| Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
| M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
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| Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
| Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
| Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
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| S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
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| Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
| Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
| Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
| Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
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References
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