通过测量细菌清除率来量化 秀丽隐杆线虫 的食物摄入量

图 1：细菌清除测定示意图。方案主要部分的图形概述（从上到下）：准备细菌，同步蠕虫种群，在 96 孔板中接种，对蠕虫进行消毒，添加药物，在第 1 天和第 4 天测量 OD600。每个描述的左侧显示了这些特定步骤的详细说明。缩写：OD = 光密度;FUdR = 氟脱氧尿嘧啶。请单击此处查看此图的较大版本。 1. 菌种制备 注意：本节详细介绍了该测定中使用的饲养细菌的制备。检测中使用的特定 大肠杆菌 菌株称为 OP50。OP50 是饲养 秀丽隐杆线虫的最广泛使用的菌株。使用的 OP50 菌株对羧青霉素/氨苄青霉素具有抗性，可防止蠕虫培养物与其他细菌的交叉污染9。 提前 4-5 天准备 OP50，并在使用前一天进行 X 射线照射。确保所有遇到 OP50 的材料都是无菌的29,30。 第 -8 天：星期三（第 1 周）：通过接种 5 mL LB 和 100 μg/mL 氨苄青霉素和 0.1 μg/mL 两性霉素 B 和单个 OP50 菌落来制备预接种物，并在 37 °C 下在细菌振荡器中孵育约 6 小时。尽早接种，让培养物充分生长，使培养物变得浑浊。 一旦培养物浑浊，在 250 mL 含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 TB 中以 1：2,000 稀释 OP50 的孕前培养物。将培养物在细菌振荡器中于 37 °C 孵育过夜 17-19 小时。注意：不应让培养物生长超过 19 小时。 第 -7 天：星期四（第 1 周）孵育 17-19 小时后，将 OP50 液体培养物转移到无菌离心管中，并在 4 °C 的台式离心机中以 3,100 × g 离心 15 分钟。 弃去上清液，用无菌水重悬 OP50 沉淀，然后重新离心。重复此洗涤 2 次。 第二次洗涤后，弃去上清液，将 OP50 沉淀重悬于无菌水中至体积为 50 mL，然后将其转移到预先称重的 50 mL 锥形管中。通过在 4 °C 的台式离心机中以 3,100 × g 离心 20 分钟来沉淀 OP50。 第三次洗涤后，小心去除所有剩余的上清液，确保试管中没有水残留。通过从带有沉淀的离心管的重量中减去空离心管的重量来计算沉淀的重量。注：颗粒重量通常在 3-3.5 g 之间。 将 OP50 沉淀在 S-完全缓冲液中彻底重悬至浓度为 100 mg/mL，确保不存在结块。 确保 100 mg/mL 的 OP50 浓度对应于 2 × 1010 个细菌/mL。如果光密度与每 mL 细菌数之间的关系已知，则通过分光光度法确定每 mL 的细菌浓度。如有必要，使用 S-完全缓冲液将 OP50 补料溶液的浓度调节至 2 × 1010 个细菌/mL。 在琼脂平板上测试 OP50 以确定其是否受到污染。 将悬浮在 4 °C 的 S-完全缓冲液中的 OP50 储存。 第 -3 天： 周一（第 2 周）通过 X 射线照射杀死细菌，以防止细菌在检测过程中生长。 2. 同步蠕虫培养物制备 注意：本节讨论同步 Worm 种群的准备工作。所有与蠕虫种群接触的材料都是无菌的。除非另有说明，否则所有板均保持在 20 °C。 第 -6 天：周五（第 1 周），下午 4：00将动物转移到新鲜的盘子中。取一个 NGM 板，其中大部分蠕虫种群由饥饿的 L1 幼虫组成。注意：混合总体也会产生结果。使用长期饥饿的 L1 蠕虫可能会影响当前或未来几代的摄食行为，因为饥饿会留下至少三代的表观遗传标记。 用不超过 1 mL 的无菌水洗掉蠕虫。将 ~300 μL 洗去的蠕虫种群分装到接种有浓 OP50 （~300 mg/mL） 的 NGM 平板上。让板在板干燥器或本生灯下干燥。在 20°C 下孵育板，直到大部分种群包含妊娠成虫（星期一）。注：此时间范围针对野生型 N2 蠕虫种群进行了优化，可能因菌株而异。应考虑发育迟缓的蠕虫，并尽早进行分块和/或尽早播种，以便所有测试的菌株都能同时达到成年。 第 -3 天：周一（第 2 周）上午 10：00建立同步填充谨慎！漂白剂对皮肤和眼睛有腐蚀性。处理它需要手套和安全眼镜。用最多 10 mL 的无菌水将蠕虫从板中清洗干净，以收集蠕虫。将此蠕虫/水溶液转移到 15 mL 锥形管中。 通过在工作台上通过重力沉降水器洗涤蠕虫约 4 分钟（相反，在 310 × g 的台式离心机中离心洗涤 2 分钟。 使用小吸头抽吸弃去上清液，并加入最多 15 mL 的无菌水。重复 3 次。 去除上清液，加入 5 mL 新鲜制备的漂白剂/NaOH 溶液（1.8 mL 家用漂白剂、0.5 mL 10 N NaOH、7.7 mL dH2O）。 在室温下孵育 5 分钟或直到蠕虫破裂。每分钟轻轻涡旋至少 10 秒。在解剖显微镜下监测进度。注意：打开蠕虫所需的时间可能因菌株而异。将蠕虫留在漂白剂溶液中太久可能会导致虫卵无法存活。 一旦所有成体裂开或溶解（最终体积为 15 mL）并以 1,300 × g 离心 2 分钟，加入 M9 缓冲液以中和反应。 用 13 mL M9 缓冲液清洗鸡蛋 3 次。 用 10 mL 的 S-完全缓冲液洗涤鸡蛋一次，以 1,300 × g 离心 2 分钟。 吸出上清液，加入 10 mL S-complete，然后将悬浮液转移至新的 15 mL 锥形管中。在室温下在章动器或类似设备上轻轻旋转管子过夜。 可选：如果在 S 完全缓冲液中最终离心后存在成体胴体，则通过 40 μm 细胞过滤器过滤蠕虫溶液。 第 -2 天：星期二（第 2 周），下午 1：00将动物播种到板中使用解剖镜检查蠕虫是否已孵化。通过使用解剖镜计数 10 μL 液滴中的蠕虫种群，确定 S-完全缓冲液中蠕虫的浓度;每个样品计数 5-10 滴。如果每 10 μL 液滴中的蠕虫浓度超过每滴 30 条蠕虫，则用 S-complete 将总储备液稀释至每滴较低的蠕虫密度，以便于计数。 将液体蠕虫混合物以 120 μL 的体积接种到 96 孔板的每个孔中，体积如下（终浓度）：60 蠕虫/mL S 完全培养基、50 μg/mL 羧苄青霉素、0.1 μg/mL 两性霉素和 6 mg/mL OP50，在第 1 部分中制备。注：要制备的总体积取决于板的数量（每个 96 孔板 ~12 mL）。每个井中应有 6-12 条蠕虫。或者，可以使用大颗粒流式细胞术，例如 Union Biometrica 的 COPAS FP，将 10 条蠕虫精确分选到每个孔中（参见拥挤效应部分）。 还包括 无蠕虫 液体混合物：第 1 部分制备的 50 μg/mL 羧青霉素、0.1 μg/mL 两性霉素和 6 mg/mL OP50。 如前所述，将 120 μL 无蠕虫混合物放入 96 孔板的 H 行中，用于确定自解值。 每孔放入 120 μL 带有蠕虫的混合物，排在 A-G 行中。注意：确保在移液过程中将蠕虫保持悬浮状态（参见 图 2A、B）。我们使用平底的透明 96 孔板。我们的板布局将板划分为产生 4 或 6 个条件，其中每对列将是不同的药物治疗或蠕虫菌株，底行将用作“无蠕虫”对照（图 2A、B）。 为避免污染和蒸发，请使用胶带密封机密封板。将板在 20 °C 下孵育约 65 小时，直到动物变成 L4 蠕虫。 第 0 天：星期四（第 2 周）中午前。通过添加氟脱氧尿嘧啶 （FUdR） 对蠕虫种群进行绝育。加入 30 μL 的 0.6 mM FUdR 储备溶液，对每个孔中的动物进行灭菌。使用胶带密封剂重新密封板，并在微量滴定板振荡器上以 800 rpm 的速度摇动板 20 分钟。将板放回 20 °C 培养箱中。注：在此步骤中，最终 OP50 浓度从 6 mg/mL 降低到 5 mg/mL（1 × 109 个细菌/mL），每个孔的最终体积为 150 μL。在动物成年之前将 FUdR 添加到 L4 阶段至关重要。 第 1 天：周五（第 2 周）向培养物中添加药物。到上午 9：00，确认大多数动物都怀孕了，并且每个孔都包含几个鸡蛋。如有必要，将任何药物添加至所需浓度（参见讨论）。 添加药物后，用胶带密封剂密封板，并在板振荡器上以 800 rpm 的速度摇动板 20 分钟。注意：摇动可确保在不接触密封剂的情况下溶解所有细菌团块。密封剂上的细菌团块或液体都会使 OD600 读数失真。如果密封剂上有液滴，请以 310 × g 的速度短暂旋转 10-20 秒。在摇床上再次摇晃 5 分钟并测量。 在微量滴定板振荡器上摇动 20 分钟后，取下盖子和密封件，并在读板器中测量 OD600 ;这是 第 1 天的 OD600 测量值。密封板并将其放回 20 °C 培养箱中。注意：由于细菌会迅速沉淀，因此读数应在摇动板后 10 分钟内出现。 如果添加了药物，请使用倒置显微镜检查蠕虫种群是否有污染或毒性迹象。将板放回 20 °C 培养箱中。 第 4 天：周一（第 3 周）读取第 4 天的 OD600 读数。从第 1 天开始重复读取程序（步骤 2.5.1.3）以获得 第 4 天的 OD600 值。在 OD600 测量之前，在微量滴定板振荡器上以 800 rpm 的速度摇动板 20 分钟。 在倒置显微镜上，理想情况下使用 2 倍物镜，计算每个孔中的蠕虫数量并将其记录在电子表格中。计数后，将板放回 20 °C 培养箱中。注意：请参阅补充材料中提供的评分表样本。 第 4 天读数后，食物摄入量测量完成。如果需要，请保留这些板以进行寿命分析。注意：该协议与 Solis 和 Petrascheck31 兼容。 3. 食物摄入量数据分析 图 2：设计和分析。（A、B） 4 和 6 种条件的可能板设计，H 行中“无蠕动”对照孔。这些孔对于确定自溶速率是必要的。在每个板中，始终包括 N 2 未处理的对照群体作为参考。（C） 在提供的电子表格中收集的样本数据，包括蠕虫数量（绿框）、第 1 天和第 4 天的两次 OD600 测量（橙色框）、自溶值（蓝框）以及使用公式 （2） 的评估（（OD600 -自解）/X0） 在红框中。此处显示的具体示例使用了 （B） 中所示的板设计。缩写：OD = 光密度;X0 = 每孔的蠕虫数。请单击此处查看此图的较大版本。 注意：本节介绍如何分析本协议第 2 节的食物摄入量数据。要计算的第一个值是自解控制值。细菌会在液体中随着时间的推移而裂解，即使没有蠕虫也是如此。这个自解值也会受到许多化学物质的影响，需要控制，因为与蠕虫的食物摄入量相比，它相对较大。如步骤 2.3.1.4 中所述，如图 2A 中的板布局所示，B 行 H 包含相同的解决方案，不包括蠕虫。在图 2B 所示的板设置中，每个条件有 14 个孔，有两个相应的自解对照孔（H 行，“无蠕虫”）。 使用等式 （1） 计算每种条件下无蠕虫对照孔的自溶对照值。对于每个重复的孔组，确保至少有两个无蠕虫对照孔，如步骤 2.3.1.4 中所述。使用所有无蠕虫对照孔的平均值作为重复组的自溶值。自拍 = 平均值（OD600 第 1 天 – OD600 第 4 天） （1）注意：对于图 2B 所示的板设置，我们将通过计算 H 行中两个自解对照孔的平均值来计算六个自解值，六组中每组一个。 使用方程式计算每条蠕虫的食物摄入量     (2).注意：电子表格中使用的公式（红框， 图 2C），其中 X0 是每孔的蠕虫数。 在确定每个井的每条蠕虫的食物摄入量后，计算整个条件的平均值和标准差。注意：对于 图 2B 所示的板设置，每个条件 14 个重复孔足以进行统计比较。 将每种情况标准化为各自的 N2 未处理对照群体。将饲喂的变化表示为 N2 饲喂的倍数变化或百分比。注：进行归一化是因为方程 （2） 中 OD 600/X0 的绝对值在不同日期进行的实验之间可能会有所不同。