Medindo a colonização bacteriana em raízes de Arabidopsis thaliana em condição hidropônica
Summary
A colonização de rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPR) na rizosfera é essencial para seu efeito promotor de crescimento. É necessário padronizar o método de detecção da colonização da rizosfera bacteriana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para quantificar a colonização bacteriana na superfície da raiz.
Abstract
A medição da colonização bacteriana na raiz de Arabidopsis thaliana é um dos experimentos mais frequentes em estudos de interação planta-micróbio. Um método padronizado para medir a colonização bacteriana na rizosfera é necessário para melhorar a reprodutibilidade. Primeiro cultivamos A.thaliana estéril em condições hidropônicas e, em seguida, inoculamos as células bacterianas na rizosfera a uma concentração final de OD600 de 0,01. Aos 2 dias após a inoculação, o tecido radicular foi colhido e lavado três vezes em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. As raízes foram então pesadas e as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas por vórtice. A suspensão celular foi diluída em um gradiente com tampão tampão salino tampão fosfato (PBS), seguido de plaqueamento em meio de ágar Luria-Bertani (LB). As placas foram incubadas a 37 °C por 10 h e, em seguida, as colônias únicas nas placas LB foram contadas e normalizadas para indicar as células bacterianas colonizadas nas raízes. Este método é usado para detectar colonização bacteriana na rizosfera em condições de monointeração, com boa reprodutibilidade.
Introduction
Existem métodos quantitativos e qualitativos para detectar a colonização da rizosfera por uma única cepa bacteriana. Para o método qualitativo, deve-se utilizar uma cepa que expresse constitutivamente a fluorescência, e a distribuição e intensidade da fluorescência devem ser examinadas em microscopia de fluorescência ou instrumentos confocais a laser 1,2. Essas estratégias podem refletir bem a colonização bacteriana in situ3, mas não são tão precisas quanto os métodos tradicionais de contagem de placas na quantificação. Além disso, devido à limitação de exibir apenas zonas radiculares parciais ao microscópio, às vezes pode ser influenciado por viés subjetivo.
Aqui, descrevemos um método quantitativo, que inclui a coleta das células bacterianas colonizadas e a contagem das UFCs bacterianas em uma placa. Este método é baseado na diluição e plaqueamento pelo qual as cepas colonizadas que foram retiradas das raízes das plantas podem ser contadas, e o número total de bactérias colonizadas na raiz pode ser calculado 4,5.
Primeiro, A. thaliana foi cultivada em condições hidropônicas e, em seguida, as células bacterianas foram inoculadas na rizosfera a uma concentração final de 0,01 OD600. Os tecidos radiculares infectados foram colhidos 2 dias após a inoculação e lavados em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. Além disso, as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas, diluídas em tampão salino tampão tampolado com fosfato (PBS) e semeadas em meio de ágar Luria-Bertani (LB). Após incubação a 37 °C por 10 h, colônias únicas em placas LB foram contadas e normalizadas para determinar as células bacterianas colonizadas nas raízes.
Este método é altamente aplicável, tem boa repetibilidade e é mais adequado para a determinação precisa da colonização bacteriana da rizosfera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obter uma boa reprodutibilidade, existem quatro etapas críticas para o processo de detecção de colonização deste protocolo. Primeiro, é necessário garantir que o número de células bacterianas inoculadas seja exatamente o mesmo em cada experimento. Em segundo lugar, também é necessário controlar a intensidade da limpeza de bactérias não colonizadas com água estéril. Terceiro, cada processo de diluição da amostra precisa ser submetido a vórtice antes de ser realizado para permitir que a amostra este…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32370135), pelo Programa de Inovação da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas (CAAS-CSAL-202302), pelo Projeto de Ciência e Tecnologia da Faculdade Vocacional de Agricultura e Silvicultura de Jiangsu (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
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