Ensemble de formats de milieux simulés in situ pour la culture de micro-organismes anaérobies acquis dans l’environnement
Summary
L’objectif de cet article est de détailler les meilleures pratiques pour la fabrication de milieux pour les micro-organismes anaérobies exigeants acquis dans un environnement. Ces méthodes aident à gérer les cultures anaérobies et peuvent être appliquées pour soutenir la croissance de micro-organismes insaisissables non cultivés, la « matière noire microbienne ».
Abstract
La recherche de microorganismes anaérobies dépendante de la culture repose sur la compétence méthodologique. Ces méthodes doivent créer et maintenir des conditions de croissance appropriées (p. ex., pH et sources de carbone) pour les microorganismes anaérobies tout en permettant d’extraire des échantillons sans compromettre l’environnement artificiel. À cette fin, les méthodes qui s’inspirent d’un environnement in situ et le simulent peuvent être d’une grande aide pour cultiver des micro-organismes de cet environnement. Ici, nous décrivons une méthode anaérobie in situ informée et simulée pour la culture de micro-organismes terrestres de surface et souterrains, en mettant l’accent sur la collecte d’échantillons anaérobies avec un minimum de perturbation. Ce protocole détaille la production d’un milieu liquide anaérobie personnalisable, ainsi que l’acquisition environnementale et la croissance in vitro de micro-organismes anaérobies. Le protocole couvre également les composants critiques d’un bioréacteur anaérobie utilisé pour les simulations environnementales de sédiments et de milieux liquides anaérobies pour les cultures acquises dans l’environnement. Nous avons inclus des données préliminaires de séquençage de nouvelle génération d’un microbiome maintenu pendant la durée de vie d’un bioréacteur où la culture active s’est ajustée dynamiquement en réponse à une source de carbone expérimentale.
Introduction
La plupart des micro-organismes restent non cultivés ; Ceci est soutenu par la grande disparité entre les cellules observée par microscopie contrastée par les quelques micro-organismes cultivés avec succès à l’aide de plaques de gélose. Staley et Konopka ont nommé cette disparité « l’anomalie du grand nombre de plaques »1. La diversité non expliquée estimée est étayée par des données métagénomiques et métatranscriptomiques montrant de nombreux nouveaux genres répartis dans des courbes d’abondance de rang à partir de plusieurs environnements différents2. Les microorganismes qui ont été observés (généralement par séquençage aléatoire d’une communauté microbienne) mais qui n’ont pas été cultivés ont été appelés « matière noire microbienne »3,4.
À l’ère des micro-omiques, la culture de micro-organismes reste impérative pour évaluer pleinement les données génomiques et vérifier la fonction/phénotype des gènes présents. Le séquençage de micro-organismes cultivés reste le seul moyen d’obtenir avec certitude des génomes complets jusqu’à ce que des technologies telles que la métagénomique shotgun et les génomes assemblés par métagénome de l’environnement deviennent infaillibles5. Les évaluations génomiques associées à des micro-organismes cultivés fournissent des inférences solides pour comprendre la « matière noire microbienne ». De nombreux membres de la « matière noire microbienne » remplissent des fonctions cruciales qui ont un impact sur le cycle des nutriments et d’autres éléments et la production de produits naturels précieux, soutiennent les systèmes écologiques et fournissent des services écologiques. D’un point de vue médical, environ la moitié de tous les produits pharmaceutiques actuellement commercialisés sont des produits et des dérivés de produits issus de bactéries, et le profilage des espèces non cultivées est soupçonné de révéler les antibiotiques du futur. Pour accéder à cette majorité inculte, une variété de méthodologies de culture doit être augmentée6. Parmi les membres de la « matière noire microbienne », les micro-organismes oligotrophes anaérobies sont largement sous-déclarés et détiennent probablement des voies biochimiques précieuses sur le plan écologique et industriel7, ce qui en fait des cibles importantes de culture. Cependant, les microorganismes oligotrophes anaérobies sont plus difficiles à cultiver que leurs homologues aérobies et copiotrophes en raison des temps d’incubation souvent plus longs, des conditions fastidieuses (p. ex., des températures in vitro non standard particulières) et de l’utilisation de recettes de milieux spécialisés.
Les techniques actuelles de développement pour cultiver des membres de la « matière noire microbienne », y compris de nouveaux micro-organismes oligotrophes anaérobies, ont considérablement amélioré notre compréhension et augmenté la représentation de ces micro-organismes dans l’arbre phylogénétique. Les techniques actuelles utilisant des milieux éclairés pour la culture de nouveaux microorganismes (c.-à-d. des milieux obtenus à partir de la connaissance du ou des microorganismes d’intérêt) peuvent être séparées en trois méthodes distinctes. La première des méthodes consiste à retirer directement une section discrète de l’environnement pour la transférer dans une chambre de croissance in vitro qui contient déjà les micro-organismes d’intérêt dans une membrane. La section discrète (p. ex., l’eau de mer) fournit aux microorganismes d’intérêt l’habitat géochimique qu’ils utilisent in situ, tandis que la membrane arrête le mouvement des cellules (les cellules d’intérêt resteront à l’intérieur ; les cellules étrangères qui sont arrivées avec la section discrète resteront à l’extérieur). En incluant des composés naturellement disponibles pour cibler les micro-organismes dans leur habitat naturel, ces micro-organismes peuvent être cultivés8. La deuxième méthode utilise la métatranscriptomique ou la génomique pour élucider les capacités métaboliques, fournissant des indices pour affiner les paramètres de culture pour une conception de milieu ciblé. Cette approche fournit un profil écophysiologique qui peut être utilisé pour cibler l’enrichissement de types spécifiques de micro-organismes hors d’un environnement. Les dispositions du milieu sont adaptées aux gènes identifiés présents qui sont présumés soutenir le ou les micro-organismes ciblés afin de réduire la diversité de l’enrichissement,9,10. Une mise en garde est que l’information génomique ne déduit pas directement l’expression des gènes, contrairement à l’information transcriptomique.
La troisième méthode englobe les milieux protégés par l’environnement et simulés, distincts de la première, qui ne simule pas les milieux, mais utilise plutôt l’environnement directement comme source de milieu. Cette troisième méthode nécessite une reconnaissance environnementale de la géochimie d’un site de terrain contenant des microorganismes d’intérêt. Grâce à ces connaissances, les composants primaires et les paramètres physiques sont identifiés pour produire un milieu simulé tenant compte de l’environnement. Le milieu reçoit ensuite une perfusion directe de sédiments ou de liquides contenant des micro-organismes de l’environnement dans le milieu. Cette méthode est particulièrement utile dans les cas où le microbiologiste d’élevage n’a pas accès à des quantités suffisantes d’environnement source (comme pour la première méthode) ni à des données métatranscriptomiques ou génomiques appropriées (comme pour la seconde).
Le protocole suivant est un exemple de la troisième méthode ; il est informé par et vise à simuler des environnements d’intérêt. Trois recettes de milieux naïfs ciblant différentes cultures de micro-organismes anaérobies acquises sur le terrain sont présentées en parallèle au sein du protocole. Les trois cultures représentées sont des cultures mixtes provenant du sol (ci-après, culture mixte du sol), des cultures mixtes provenant d’un trou de forage (ci-après, culture mixte de forage) et un méthanogène isolé provenant de l’intérieur d’un trou de forage (ci-après, méthanogène isolé du trou de forage). Les identités et les quantités composées dans les recettes médiatiques partagées ici sont destinées à servir de guide de départ ; Ils peuvent et sont encouragés à être personnalisés en fonction de l’environnement du lecteur et des micro-organismes d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
La section de production moyenne de ce protocole (section 1) doit sa structure à la technique Hungate modifiée de Miller et Wolin17, qui a été largement utilisée depuis sa publication. L’aspect pratique de ce protocole élargi vient de sa nature descriptive et de son appariement avec l’acquisition in situ de micro-organismes. Des flacons de culture contenant des milieux de simulation et de respect de l’environnement ont été utilisés pour cultiver avec succès les anciens mem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner la lignée d’information et de mentorat qui a influencé/fait évoluer ces techniques au fil des ans. Le Dr Hamilton-Brehm, en tant qu’ancien étudiant diplômé, postdoctorant et professeur actuel, a une dette de gratitude envers ceux qui ont pris le temps d’enseigner les techniques anaérobies : le Dr Mike Adams, le Dr Gerti Schut, le Dr Jim Elkins, le Dr Mircea Podar, le Dr Duane Moser et le Dr Brian Hedlund. The Nature Conservancy et American Rivers ont soutenu ce travail par le biais des subventions G21-026-CON-P et AR-CE21GOS373, respectivement. Les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de Nature Conservancy ou d’American Rivers. Ce travail a été soutenu par une subvention du SIU Advanced Energy Institute, qui remercie le financement accordé par l’intermédiaire de l’Advanced Energy Resource Board. NGS a été réalisé par LC Sciences.
Materials
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
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