Quantification des anticorps autoréactifs chez la souris lors d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale
Summary
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.
Abstract
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle de maladie qui récapitule la maladie auto-immune de la sclérose en plaques (SEP) aux niveaux histopathologique et moléculaire. L’EAE est induite par l’immunisation d’animaux de laboratoire par injection sous-cutanée de peptides de myéline courts associés à des adjuvants spécifiques pour stimuler la réponse immunitaire. Comme leurs homologues humains, les souris EAE développent des lésions démyélinisantes, une infiltration de cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC), une activation gliale et des lésions neuronales. De nombreuses données probantes confirment également l’existence d’un rôle mécaniste du dysfonctionnement des lymphocytes B dans l’étiologie de la SP et de l’EAE. Les lymphocytes B peuvent servir de cellules présentatrices d’antigènes ainsi que de source primaire de cytokines pro-inflammatoires et d’auto-anticorps. Dans l’EAE, des anticorps sont générés contre les peptides de myéline qui ont été utilisés pour induire la maladie. Il a été démontré que ces auto-anticorps médient soit la perte de myéline, soit la réactivation des lymphocytes T pathogènes dans le SNC. Cet article décrit un protocole efficace basé sur l’ELISA pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris C57BL/6J immunisées avec le peptide de la glycoprotéine 35-55 de la myéline oligodendrocyte (MOG35-55). La méthode proposée constitue un outil puissant pour étudier la spécificité et l’ampleur de la réponse humorale aberrante dans le contexte de la démyélinisation auto-immune.
Introduction
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration focale de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral, une dégradation des gaines de myéline enveloppant les axones, une activation de la glie et une perte neuronale1. En plus du rôle bien établi des lymphocytes T pathogènes, de multiples éléments de preuve ont mis en évidence l’implication des lymphocytes B dans la médiation de la réponse auto-immune contre le SNC. Les lymphocytes B subissent une expansion clonale dans le cerveau de la SP et des anticorps dirigés contre les composants de la myéline ont été détectés dans les lésions démyélinisées 2,3. L’activation sélective des lymphocytes B périphériques au début de la maladie a été récemment documentée, suggérant un rôle présumé de ce compartiment cellulaire immunitaire dans l’initiation de la maladie4. Le succès des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B, telles que les anticorps monoclonaux anti-CD20, corrobore davantage le lien mécaniste entre le fonctionnement aberrant des lymphocytes B et la démyélinisation auto-immune 5,6. D’un point de vue moléculaire, les lymphocytes B peuvent contribuer à la maladie via la présentation d’auto-antigènes, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et la production d’anticorps autoréactifs.
De multiples modèles animaux ont été mis au point pour récapituler les caractéristiques spécifiques du phénotype complexe de la SP. Parmi eux, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le paradigme in vivo le plus largement utilisé et repose sur l’immunisation d’animaux de laboratoire avec des peptides courts dérivés de protéines de myéline telles que la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) et la protéine basique de la myéline (MBP)7. Les animaux immunisés contre l’EAE développent une pathologie démyélinisante qui ressemble à la SEP à bien des égards, y compris une réponse humorale robuste contre le peptide encéphalitogène8. Pour cette raison, les études EAE ont joué un rôle déterminant dans la dissection de la fonction des lymphocytes B et des auto-anticorps dans le contexte de la maladie. Par exemple, il a été démontré que les anticorps spécifiques de MOG isolés chez des patients atteints de SEP peuvent aggraver l’évolution clinique dans les modèles EAE9. Notamment, le résidu de proline à la position 42 dans le MOG humain s’est avéré essentiel pour déterminer la pathogénicité des auto-anticorps10. Plus récemment, il a été constaté que les auto-anticorps spécifiques de MOG favorisent la maladie non seulement en médiant la perte de myéline, mais aussi en stimulant la réactivation des lymphocytes T autoréactifs dans le SNC11.
Compte tenu de l’importance des réponses anticorps dans l’auto-immunité du SNC, cet article présente un protocole basé sur ELISA pour mesurer efficacement les taux sériques d’anticorps autoréactifs chez les souris C57BL/6J EAE immunisées avec le peptide MOG35-55. Dans la première partie du protocole, la méthode de prélèvement du sérum par ponction intracardiaque sera décrite. Par la suite, les procédures de mise en place du test ELISA et d’acquisition des données seront détaillées. Enfin, l’analyse et l’interprétation des données seront abordées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, un protocole simple et efficace basé sur l’ELISA a été rapporté pour quantifier avec précision la réponse humorale dans un modèle animal pertinent de la pathologie de la SEP. Cette méthode a récemment été utilisée pour décrire le nouveau rôle de la protéine ataxine-1 dans le contrôle des taux sériques d’auto-anticorps dans le paradigme MOG35-55/C57BL6J EAE12. À cet égard, un certain nombre de facteurs doivent être pris en considération afin d’obtenir des résultats …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (R03NS131908) et le ministère de la Défense par le biais du programme de recherche sur la sclérose en plaques sous le numéro de bourse W81XWH-22-1-0517. Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Cette étude a également été soutenue par des fonds de démarrage de l’Université de Caroline de l’Est.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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