Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması
Summary
İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC’lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.
Abstract
İnsan enterik sinir sistemi, ENS, dikkate değer nörotransmitter çeşitliliğine sahip geniş bir glial ve nöronal hücre tipleri ağıdır. ENS bağırsak hareketliliğini, enzim sekresyonunu ve besin emilimini kontrol eder ve bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu ile etkileşime girer. Sonuç olarak, ENS’nin gelişimsel ve edinilmiş kusurları birçok insan hastalığından sorumludur ve Parkinson hastalığının semptomlarına katkıda bulunabilir. Hayvan model sistemlerindeki sınırlamalar ve birincil dokuya erişim, insan ENS çalışmalarında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) ENS soylarının etkili in vitro türetilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Protokolümüz, 15 gün içinde hPSC’lerin enterik nöral krest hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ile başlar ve 30 gün içinde fonksiyonel enterik nöronların çeşitli alt tiplerini verir. Bu platform, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif uygulamalar için ölçeklenebilir bir kaynak sağlar.
Introduction
Enterik sinir sistemi (ENS), periferik sinir sisteminin en büyük bileşenidir. ENS, gastrointestinal sistem içinde yer alan ve bağırsağın neredeyse tüm fonksiyonlarını kontrol eden 400 milyondan fazla nöron içerir1. ENS gelişimi ve fonksiyonu ile enterik nöropatilerdeki kusurlarının moleküler olarak anlaşılması, güvenilir ve otantik bir enterik nöron kaynağına erişim gerektirir. İnsan primer dokusuna erişim sınırlıdır ve hayvan modelleri birçok enterik nöropatide anahtar hastalık fenotiplerini özetlemekte başarısız olmaktadır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) teknolojisinin, özellikle birincil kaynaklardanizole edilmesi zor olanlar olmak üzere, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir kaynağını sağlamada son derece faydalı olduğu kanıtlanmıştır 2,3,4,5,6,7. Burada, hPSC’lerden ENS kültürleri elde etmek için aşamalı ve sağlam bir in vitro yöntemin ayrıntılarını sunuyoruz. Bu ölçeklenebilir hPSC’den türetilmiş kültürler, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi ve yüksek verimli ilaç taraması için yollar açar ve rejeneratif tıp için nakledilebilir hücreler sağlayabilir.
Enterik nöron soyları, embriyogenez sırasında ENS gelişim yolunu izleyen nöral krest (NC) hücrelerinden türetilir. Embriyolarda, NC hücreleri katlanan nöral plakanın kenarları boyunca ortaya çıkar. Çoğalırlar, göç ederler ve duyusal nöronlar, Schwann hücreleri, melanositler, kraniyofasiyal iskelet ve enterik nöronlar ve glia 8,9,10 dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipine yol açarlar. Hücre kaderi kararı, NC hücrelerinin çıktığı ön-arka eksen boyunca farklı bölgeye, yani kraniyal NC, vagal NC, gövde NC ve sakral NC’ye bağlıdır. ENS, vagal ve sakral NC hücrelerinden gelişir ve birincisi, bağırsağın uzunluğu boyunca geniş göç ve bağırsağı kolonize etmesi nedeniyle enterik nöronların popülasyonuna hakimdir11.
NC hücrelerinin PSC’lerden türetilmesi genellikle ikili SMAD inhibisyonu ve WNT yolu aktivasyonunun bir kombinasyonunu içerir12,13. Yakın zamana kadar, tüm NC indüksiyon protokolleri, kültür koşullarında serum ve diğer hayvansal ürün katkı maddelerini içeriyordu. Kimyasal olarak tanımlanmamış ortamlar sadece NC indüksiyonunun tekrarlanabilirliğini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda mekanik gelişimsel çalışmalara da meydan okur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Barber ve ark.14, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarını kullanarak bir NC indüksiyon protokolü geliştirdi ve bu nedenle serum replasman faktörlerine (örneğin, KSR) dayanan alternatif yöntemlere göre avantajlıydı13,14. Bu, bazal medya replasmanları ve orijinal olarak Fattahi ve arkadaşları tarafından hPSC’lerden enterik NC hücreleri türetmek için sunulan bir protokolün optimize edilmesiyle elde edildi. Bu geliştirilmiş sistem, burada sunulan hPSC farklılaşma protokolünün temelidir. Retinoik aside (RA) ek olarak BMP, FGF, WNT ve TGFβ sinyallerinin hassas modülasyonu ile 15 günlük bir süre içinde enterik nöral krest (ENC) hücrelerinin indüksiyonu ile başlar. Daha sonra, hücreleri glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF) ile tedavi ederek ENS soylarını türetiriz. Tüm besiyeri bileşimleri kimyasal olarak tanımlanır ve 30-40 gün içinde sağlam enterik nöronal kültürler verir.
Burada tarif edilen tek katmanlı hücre kültürü sistemine ek olarak, serbest yüzen embriyoid cisimciklerini kullanan alternatif NC indüksiyon yaklaşımları geliştirilmiştir 15,16. Bu kültürlerdeki göçmen hücrelerin, vagal NC’yi temsil eden bir alt küme ile NC belirteçlerini eksprese ettiği gösterilmiştir. Primer barsak dokusu ile ko-kültürler, bu kültürlerde enterik NC öncüllerini zenginleştirmek için kullanılmıştır. Bu çalışmalardaki medya kompozisyonları, sinir büyüme faktörü, NT3 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör gibi farklı faktörlerin bir kombinasyonunu içerir. Bu aşamada, bu faktörlerin enterik nöron öncü bağlılık kimliklerini nasıl etkileyebileceği tam olarak açık değildir. Tek tabakalı enterik NC indüksiyonunun ve embriyoid-vücut bazlı kültürlerin etkili bir şekilde karşılaştırılması için daha fazla veri gereklidir. Bu stratejilerdeki farklı kültür düzenleri göz önüne alındığında, her bir yöntemin kullanımı göz önünde bulundurularak belirli bir uygulamaya göre dikkate alınmalı ve optimize edilmelidir.
Burada sunulan protokol tekrarlanabilir ve biz ve diğerleri tarafından farklı hPSC (indüklenmiş ve embriyonik) hatları kullanılarak başarıyla test edilmiştir 8,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen farklılaşma protokolü, 30-40 gün içinde hPSC’lerden enterik nöronlar elde etmek için sağlam bir in vitro yöntem sağlar (Şekil 1E) ve daha eski kültürlerde glial fibriler asidik protein, GFAP ve SOX10 eksprese eden enterik glia (> gün 55)13,14,19,22. Bu nöronlar ve glia, hPSC’lerin vagal ve enterik nöral krest hücrelerin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı ve Sandler Vakfı, March of Dimes hibe no. 1-FY18-394 ve 1DP2NS116769-01, NIH Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2NS116769) F.F.’ye ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK121169) F.F.’ye, HM, Larry L. Hillblom Vakfı doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. NIH T32-DK007418 bursu ve UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı bağımsız doktora sonrası bursu.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
References
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
- Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
- Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
- Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
- Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
- Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
- Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
- Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).
