تمايز سلالات الجهاز العصبي المعوي عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
يوفر اشتقاق سلالات الجهاز العصبي المعوي (ENS) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا لدراسة تطور ENS والمرض ، واستخدامه في الطب التجديدي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل في المختبر لاشتقاق الخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا.
Abstract
الجهاز العصبي المعوي البشري ، ENS، هو شبكة كبيرة من أنواع الخلايا الدبقية والعصبية مع تنوع ملحوظ في الناقلات العصبية. يتحكم ENS في حركة الأمعاء وإفراز الإنزيم وامتصاص العناصر الغذائية ويتفاعل مع الجهاز المناعي وميكروبيوم الأمعاء. وبالتالي ، فإن العيوب التنموية والمكتسبة في ENS هي المسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية وقد تسهم في أعراض مرض باركنسون. تشكل القيود في أنظمة النماذج الحيوانية والوصول إلى الأنسجة الأولية تحديات تجريبية كبيرة في دراسات ENS. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للاشتقاق الفعال في المختبر لسلالات ENS من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، hPSC ، باستخدام ظروف ثقافة محددة. يبدأ بروتوكولنا بالتمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا القمة العصبية المعوية في غضون 15 يوما وينتج أنواعا فرعية متنوعة من الخلايا العصبية المعوية الوظيفية في غضون 30 يوما. توفر هذه المنصة موردا قابلا للتطوير للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والتطبيقات التجديدية.
Introduction
الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو أكبر مكون للجهاز العصبي المحيطي. يحتوي ENS على أكثر من 400 مليون خلية عصبية تقع داخل الجهاز الهضمي وتتحكم في جميع وظائف القناة الهضمية 1تقريبا. يتطلب الفهم الجزيئي لتطور ووظيفة ENS وعيوبه في اعتلالات الأعصاب المعوية الوصول إلى مصدر موثوق وأصيل للخلايا العصبية المعوية. الوصول إلى الأنسجة الأولية البشرية محدود ، وتفشل النماذج الحيوانية في تلخيص الأنماط الظاهرية الرئيسية للمرض في العديد من اعتلالات الأعصاب المعوية. أثبتت تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) أنها مفيدة للغاية في توفير مصدر غير محدود لأنواع الخلايا المرغوبة ، خاصة تلك التي يصعب عزلها عن المصادر الأولية2،3،4،5،6،7. هنا ، نقدم تفاصيل عن طريقة تدريجية وقوية في المختبر للحصول على ثقافات ENS من hPSCs. تفتح هذه الثقافات المشتقة من hPSC القابلة للتطوير سبلا للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ويمكن أن توفر خلايا قابلة للزرع للطب التجديدي.
يتم اشتقاق سلالات الخلايا العصبية المعوية من خلايا القمة العصبية (NC) التي تتبع مسار تطور ENS أثناء التطور الجنيني. في الأجنة ، تظهر خلايا NC على طول هوامش الصفيحة العصبية القابلة للطي. تتكاثر وتهاجر وتؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية وخلايا شوان والخلايا الصباغية والهيكل العظمي القحفي الوجهي والخلايا العصبية المعوية والدبقية8،9،10. يعتمد قرار مصير الخلية على المنطقة المميزة على طول المحور الأمامي الخلفي الذي تخرج منه خلايا NC ، أي NC القحفي ، NC المبهم ، الجذع NC و NC العجزي. يتطور ENS من خلايا NC المبهمة والعجزية مع سيطرة الأولى على سكان الخلايا العصبية المعوية بسبب الهجرة الواسعة على طول الأمعاء واستعمار الأمعاء11.
عادة ما يتضمن اشتقاق خلايا NC من PSCs مزيجا من تثبيط SMAD المزدوج وتنشيط مسار WNT12,13. حتى وقت قريب ، تضمنت جميع بروتوكولات تحريض NC المصل وإضافات المنتجات الحيوانية الأخرى في ظروف الاستزراع. لا تقلل الوسائط غير المحددة كيميائيا من قابلية استنساخ تحريض NC فحسب ، بل تتحدى أيضا الدراسات التنموية الآلية. للتغلب على هذه التحديات ، طور Barber etal 14 بروتوكول تحريض NC باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا ، وبالتالي كان مفيدا على الطرق البديلة التي تعتمد على عوامل استبدال المصل (على سبيل المثال ، KSR) 13،14. تم الحصول على هذا عن طريق استبدال الوسائط القاعدية وتحسين بروتوكول قدمه في الأصل Fattahi et al لاشتقاق خلايا NC المعوية من hPSCs. هذا النظام المحسن هو أساس بروتوكول التمايز hPSC المعروض هنا. يبدأ بتحريض خلايا القمة العصبية المعوية (ENC) في فترة 15 يوما عن طريق التعديل الدقيق لإشارات BMP و FGF و WNT و TGFβ بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA). ثم نشتق سلالات ENS عن طريق علاج الخلايا بعامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF). يتم تعريف جميع تركيبات الوسائط كيميائيا وتنتج ثقافات عصبية معوية قوية في غضون 30-40 يوما.
بالإضافة إلى نظام زراعة الخلايا أحادية الطبقة الموصوف هنا ، تم تطوير مناهج تحريض NC بديلة تستخدم الأجسام الجنينية العائمةالحرة 15,16. وقد تبين أن الخلايا المهاجرة في هذه الثقافات تعبر عن علامات NC مع مجموعة فرعية تمثل NC المبهم. تم استخدام الثقافات المشتركة مع أنسجة الأمعاء الأولية لإثراء سلائف NC المعوية في هذه الثقافات. تحتوي تركيبات الوسائط في هذه الدراسات على مجموعة من العوامل المختلفة مثل عامل نمو الأعصاب و NT3 وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. في هذه المرحلة ، ليس من الواضح تماما كيف يمكن أن تؤثر هذه العوامل على هويات الالتزام بسلائف الخلايا العصبية المعوية. لإجراء مقارنة فعالة لتحريض NC المعوي في الطبقة الأحادية والثقافات القائمة على الجسم الجنيني ، يلزم المزيد من البيانات. بالنظر إلى تخطيطات الثقافة المختلفة في هذه الاستراتيجيات ، يجب النظر في استخدام كل طريقة وتحسينها وفقا لتطبيق محدد في الاعتبار.
البروتوكول المقدم هنا قابل للتكرار وقد تم اختباره بنجاح من قبلنا ومن قبل الآخرين باستخدام خطوط hPSC المختلفة (المستحثة والجنينية)8،14،16.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة قوية في المختبر للحصول على الخلايا العصبية المعوية من hPSCs في غضون 30-40 يوما (الشكل 1E) والدبقية المعوية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، GFAP ، و SOX10 في الثقافات القديمة (> اليوم 55)13،14،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل بمنح من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية المتقدمة ومؤسسة ساندلر ، ومنحة March of Dimes رقم 1-FY18-394 و 1DP2NS116769-01 ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2NS116769) إلى FF والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK121169) إلى FF ، HM مدعوم من زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة Larry L. Hillblom ، زمالة NIH T32-DK007418 وبرنامج UCSF لزمالة ما بعد الدكتوراه المستقلة للبحوث الطبية الحيوية.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
References
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
- Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
- Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
- Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
- Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
- Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
- Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
- Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).
