Tragbarer papierbasierter Immunoassay kombiniert mit Smartphone-Anwendung für den kolorimetrischen und quantitativen Nachweis des Dengue-NS1-Antigens
Summary
Um dringende diagnostische Anforderungen an Dengue zu erfüllen, stellen wir hier ein in die Smartphone-App integriertes Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) zur Quantifizierung der Dengue NS1-Antigenkonzentration in klinischen Serum-/Blutproben vor. Diese Innovation verbessert das Dengue-Management, indem sie die klinische Entscheidungsfindung in verschiedenen Gesundheitseinrichtungen unterstützt, auch in ressourcenbegrenzten.
Abstract
Die Infektion mit dem Dengue-Virus (DENV), die von Aedes-Mücken übertragen wird, ist ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit in tropischen und subtropischen Ländern. Bei einer jährlichen Inzidenz von etwa 10 Millionen Fällen und 20.000 bis 25.000 Todesfällen, insbesondere bei Kindern, besteht ein dringender Bedarf an praktischen Diagnoseinstrumenten. Das Vorhandensein von Dengue-Nichtstrukturprotein 1 (NS1) während einer frühen Infektion wurde mit der Freisetzung von Zytokinen, vaskulärer Leckage und endothelialer Dysfunktion in Verbindung gebracht, was es zu einem potenziellen Marker für schweres Dengue-Fieber macht.
Papierbasierte Immunoassays wie Lateral-Flow-Assays (LFAs) und mikrofluidische papierbasierte Analysegeräte (PADs) haben aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit, Kosten, Spezifität und Leichtigkeit der Interpretation als diagnostische Tests an Popularität gewonnen. Herkömmliche papierbasierte Immunoassays für den Dengue-NS1-Nachweis beruhen jedoch in der Regel auf einer visuellen Inspektion und liefern nur qualitative Ergebnisse. Um diese Einschränkung zu beheben und die Empfindlichkeit zu erhöhen, schlugen wir einen hochgradig tragbaren NS1-Dengue-Nachweis-Assay auf einem papierbasierten Analysegerät (PAD) vor, nämlich DEN-NS1-PAD, das eine Smartphone-Anwendung als kolorimetrisches und quantitatives Lesegerät integriert. Das Entwicklungssystem ermöglicht die direkte Quantifizierung von NS1-Konzentrationen in klinischen Proben.
Serum- und Blutproben von Patienten wurden verwendet, um die Leistung des Systemprototyps zu demonstrieren. Die Ergebnisse wurden sofort erhalten und können für die klinische Bewertung verwendet werden, sowohl in gut ausgestatteten Gesundheitseinrichtungen als auch in ressourcenbegrenzten Umgebungen. Diese innovative Kombination aus einem papierbasierten Immunoassay mit einer Smartphone-Anwendung bietet einen vielversprechenden Ansatz für den verbesserten Nachweis und die Quantifizierung des Dengue-NS1-Antigens. Durch die Erhöhung der Empfindlichkeit über die Möglichkeiten des bloßen Auges hinaus birgt dieses System ein großes Potenzial für die Verbesserung der klinischen Entscheidungsfindung bei der Dengue-Behandlung, insbesondere in abgelegenen oder unterversorgten Gebieten.
Introduction
Die Infektion mit dem Dengue-Virus (DENV) ist die sich am schnellsten ausbreitende durch Mücken übertragene Krankheit1, und mehr als 390 Millionen Menschen sind mit 96 Millionen symptomatischen Infektionen infiziert, 2 Millionen Fälle schwerer Erkrankungen und mehr als 25.000 Todesfälle pro Jahr treten weltweit auf 1,2. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind schätzungsweise 3,9 Milliarden Menschen von Dengue bedroht; ~70% leben in den Ländern des asiatisch-pazifischen Raums und hauptsächlich in Südostasien3. Im Jahr 2019 betrug die Zahl der der WHO gemeldeten Dengue-Fälle 4,2 Millionen, und Thailand trug mindestens 136.000 Dengue-Fälle und 144 Todesfälle durch Dengue-Infektionbei 4. Der Dengue-Ausbruch in Thailand tritt während der Regenzeit von April bis Dezember sowohl in städtischen als auch in ländlichen Gebieten auf, insbesondere im Nordosten.
DENV-Infektionen haben unterschiedliche klinische Manifestationen, die von subklinischen Symptomen, leichtem Dengue-Fieber (DF) bis hin zu schwerem hämorrhagischem Dengue-Fieber (DHF) reichen. Das Hauptmerkmal einer schweren DHF-Erkrankung ist eine erhöhte Gefäßpermeabilität, gefolgt von Schock und Organfunktionsstörungen1. Das Verständnis des molekularen Signalwegs, der das Gefäßleck verursachen kann, ist sehr wichtig für die Entwicklung wirksamer Dengue-Behandlungen. Dengue-Nichtstrukturprotein 1 (NS1) ist ein sezerniertes Glykoprotein während einer frühen Virusinfektion 5,6 und fungiert als Cofaktor für die virale RNA-Replikation7. NS1 kann die Freisetzung von Zytokinen auslösen und zum Gefäßleck beitragen, indem es an den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) und die endotheliale Glykokalyxbindet 8,9. In-vitro-Forschungen haben gezeigt, dass NS1 mit Endothelzellen interagiert und Apoptose induziert. Dieser Zustand kann zu endothelialer Dysfunktion und Gefäßleckbeitragen 10. Die NS1-Antigenspiegel, korreliert mit den Serum-Interleukin (IL)-10-Spiegeln, waren bei Patienten mit schwerer klinischer Erkrankung signifikant erhöht11. Dengue NS1 trägt auch zur Krankheitspathogenese bei, indem es IL-10 induziert und DENV-spezifische T-Zell-Antworten unterdrückt12,13. Darüber hinaus war das Dengue-NS1-Protein mit einer schweren klinischen Erkrankung verbunden, und die Konzentration von NS1 > 600 ng ml-1 in den ersten 3 Tagen der Krankheit war mit der Entwicklung von DHF14 verbunden.
Die Persistenz des Dengue-NS1-Antigens bei Patienten mit DHF könnte als Marker für schweres Dengue-6 verwendetwerden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von NS1 in klinischen Proben, wie z. B. den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und den Schnelltest15. Der Goldstandard für die Messung der Konzentration von NS1-Proteinen im klinischen Umfeld ist die ELISA-Methode. Die ELISA-Methode ist jedoch teuer und erfordert qualifiziertes Personal und Laboreinrichtungen16. Daher ist die Entwicklung der Technologie zum Nachweis und zur Quantifizierung von NS1-Proteinen im Point-of-Care-Test (POCT) noch nicht abgeschlossen. In den letzten zehn Jahren sind papierbasierte Immunoassays wie Lateral-Flow-Assays (LFAs) und mikrofluidische papierbasierte Analysegeräte (μPADs) aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit, Kosteneffizienz und Spezifität als diagnostische Tests beliebt geworden 17,18,19. In einem papierbasierten Immunoassay wurden mehrere Markierungen verwendet, um Signale zu erzeugen, wie z. B. Goldnanopartikel (AuNPs)20, magnetische Nanopartikel21,22, Quantenpunkte23 und Fluoreszenzmaterialien24,25. AuNPs sind die am häufigsten verwendeten Etiketten in papierbasierten Immunoassays aufgrund ihrer kostengünstigen Produktionskosten, einfachen Herstellung, Stabilität und einfachen Ablesung. Derzeit werden Lateral-Flow-Assays (LFAs) für Dengue NS1 bekanntermaßen im klinischen Umfeld eingesetzt26,27. Bei der herkömmlichen LFA-Markierungserkennung wird jedoch häufig mit bloßem Auge gearbeitet und nur qualitative Ergebnisse geliefert.
In den letzten zehn Jahren wurden weltweit mehr als 5 Milliarden Smartphones eingesetzt, und es besteht Potenzial für die Entwicklung einer tragbaren Erkennung 28,29. Smartphones verfügen über multifunktionale Fähigkeiten wie eingebaute physische Sensoren, Multi-Core-Prozessoren, Digitalkameras, USB-Anschlüsse, Audioanschlüsse, WLAN und Anwendungssoftware, wodurch sie für den Einsatz in verschiedenen Biosensorplattformen geeignetsind 30. Darüber hinaus ermöglichen drahtlose Technologien einen schnellen Datenversand und können für die Echtzeit- und Vor-Ort-Überwachung verwendet werden31. Mudanyali et al. kombinierten den papierbasierten Immunoassay und Smartphones, um eine tragbare, gerätelose, schnelle, kostengünstige und benutzerfreundliche POCT-Plattform für Malaria, Tuberkulose und HIV32 zu entwickeln. Ling et al. berichteten über einen Lateral-Flow-Assay in Kombination mit einer Smartphone-Kamera, um die alkalische Phosphatase-Aktivität in Milch quantitativ nachzuweisen33. Hou et al. entwickelten auch ein Smartphone-basiertes, dual-modales Bildgebungssystem für quantitative Signale von Farbe oder Fluoreszenz im Lateral-Flow-Assay34. Darüber hinaus kann die Verwendung des Smartphones als kolorimetrisches und quantitatives Lesegerät die Empfindlichkeit verbessern, während das bloße Auge das Vorhandensein des Ziels35 nicht sicher melden kann.
Das DEN-NS1-PAD36,37,38 (im Folgenden als Gerät bezeichnet) stellt einen Durchbruch in der Dengue-Diagnostik dar und bietet eine tragbare und effiziente Lösung. Mit Hilfe von wachsgedruckter mikrofluidischer papierbasierter Technologie quantifiziert dieses Gerät NS1 mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität durch Bildverarbeitung. Um den Nutzen weiter zu erhöhen, haben wir eine benutzerfreundliche Smartphone-App für die kolorimetrische und quantitative Ablesung entwickelt. Die klinische Validierung anhand von Patientenproben aus thailändischen Krankenhäusern unterstreicht die unmittelbare Wirkung auf die Echtzeit-Patientenbeurteilung. Unsere Innovation markiert einen entscheidenden Fortschritt im optimierten Point-of-Care-Dengue-Management und verspricht, die Diagnostik in ressourcenbegrenzten Gesundheitslandschaften zu revolutionieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einer der wichtigsten Designparameter für ein Smartphone-basiertes Lesesystem ist die Fähigkeit, eine reproduzierbare bildgebende Verarbeitung von Proben zu ermöglichen. In dieser Studie wurden die Bilder der Einfachheit und Bequemlichkeit halber von drei verschiedenen Smartphone-Marken mit 12-13-MP-Kameras aufgenommen, ohne eine Bildbox oder Zubehör zu verwenden. Variable Bedingungen der Bildaufnahme, wie z. B. die Auflösung der Kamera, die Bildaufnahmezeit, die Lichtverhältnisse und die Umgebung, können die Farb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.H.P. dankt dem Stipendienforschungsfonds der Universitas Islam Indonesia (UII). Die Autoren danken Herrn Nutchanon Ninyawee für sein wertvolles Fachwissen und seine Unterstützung während der Entwicklung der mobilen Anwendung und seine Beiträge zum Manuskript. Darüber hinaus würdigen die Autorinnen und Autoren die finanzielle Unterstützung durch Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (Projekt-Nr. FRB660073/0164) im Rahmen des Programms Smart Healthcare der King Mongkut’s University of Technology Thonburi.
Materials
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
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