Drosophila Larva Beyin ve Hücre Hattından Poli A Kuyruk Uzunluğunun Ölçülmesi
Summary
Protokol, diğer türlerden dokulara veya hücre tiplerine kolayca uyarlanabilen, Drosophila sinir sisteminden ilgilenilen genin poli(A) uzunluğunu ölçmek için verimli ve güvenilir bir yöntemi açıklar.
Abstract
Poliadenilasyon, mRNA moleküllerinin 3′ ucuna poli(A) kuyrukları ekleyen çok önemli bir transkripsiyon sonrası modifikasyondur. Poli(A) kuyruğunun uzunluğu, hücresel süreçler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. mRNA poliadenilasyonunun düzensizliği, anormal gen ekspresyonu ve kanser, nörolojik bozukluklar ve gelişimsel anormallikler dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, poliadenilasyonun dinamiklerini anlamak, mRNA işleme ve transkripsiyon sonrası gen regülasyonunun karmaşıklıklarını çözmek için hayati önem taşır.
Bu makale, Drosophila larva beyinlerinden ve Drosophila Schneider S2 hücrelerinden izole edilen RNA örneklerinde poli(A) kuyruk uzunluklarını ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Maya poli(A) polimeraz kullanılarak mRNA’nın 3′ ucuna G/I kalıntılarının enzimatik eklenmesini içeren guanozin/inosin (G/I) kuyruk yaklaşımını kullandık. Bu modifikasyon, RNA’nın 3′ ucunu enzimatik bozulmadan korur. Korunan tam uzunluktaki poli(A) kuyruklar daha sonra evrensel bir antisens astar kullanılarak ters kopyalanır. Daha sonra, PCR amplifikasyonu, ters transkripsiyon için kullanılan evrensel bir dizi oligo ile birlikte ilgilenilen geni hedefleyen gene özgü bir oligo kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu, ilgilenilen genin poli(A) kuyruklarını kapsayan PCR ürünleri üretir. Poliadenilasyon tek tip bir modifikasyon olmadığından ve farklı uzunluklarda kuyruklarla sonuçlandığından, PCR ürünleri bir dizi boyut gösterir ve bu da agaroz jel üzerinde bir leke desenine yol açar. Son olarak, PCR ürünleri yüksek çözünürlüklü kapiler jel elektroforezine tabi tutulur, ardından poli(A) PCR ürünlerinin ve gene özgü PCR ürününün boyutları kullanılarak miktar tayini yapılır. Bu teknik, poli(A) kuyruk uzunluklarını analiz etmek için basit ve güvenilir bir araç sunarak, mRNA regülasyonunu yöneten karmaşık mekanizmalar hakkında daha derin bilgiler edinmemizi sağlar.
Introduction
Çoğu ökaryotik mRNA, kanonik poli(A) polimerazlar tarafından şablonlanmamış adenosinlerin eklenmesiyle çekirdekteki 3′ terminallerinde transkripsiyon sonrası poliadenillenir. Bozulmamış bir poli(A) kuyruğu, mRNA’nın yaşam döngüsü boyunca çok önemlidir, çünkü mRNA nükleer ihracatı1 için gereklidir, translasyon verimliliğiniartırmak için poli(A) bağlayıcı proteinlerle etkileşimi kolaylaştırır 2 ve bozunmayakarşı direnç kazandırır 3. Bazı durumlarda, poli(A) kuyruğu, kanonik olmayan poli(A) polimerazlar4 tarafından kolaylaştırılan sitoplazmada da uzamaya uğrayabilir. Sitoplazmada, poli (A) kuyruk uzunluğu dinamik olarak değişir ve mRNA molekülünün ömrünü etkiler. Kuyruk uzunluğunu 5,6,7 modüle etmek için çok sayıda polimeraz ve deadenilaz bilinmektedir. Örneğin, poli(A) kuyruklarının kısalması translasyonel baskılama ile ilişkilidir, oysa poli(A) kuyruklarının uzatılması translasyonu artırır 8,9.
Biriken genomik çalışmalar, ökaryotik biyolojinin çeşitli yönlerinde poli(A) kuyruk uzunluğunun temel önemini göstermiştir. Bu, germ hücresi gelişimi, erken embriyonik gelişim, öğrenme ve hafıza için nöronal sinaptik plastisite ve inflamatuar yanıttaki rolleri içerir10. Poli(A) kuyruk uzunluklarını ölçmek için geliştirilmiş çok sayıda yöntem ve tahlil vardır. Örneğin, RNase H/oligo(dT) testi, poli(A) kuyruk uzunluğu 11,12’yi incelemek için oligo(dT) varlığında veya yokluğunda RNase H’den yararlanır. Poli(A) kuyruğunu incelemek için diğer yöntemler arasında, cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu poli(A) testi (RACE-PAT)12,13 ve ligaz aracılı poli(A) testi (LM-PAT)14 gibi 3′ uçların PCR amplifikasyonu yer alır. PAT tahlilinin diğer modifikasyonları arasında ePAT15 ve sPAT16 bulunur. Enzimatik G-tailing17,18 veya 3′ ucunun G/I-tailing’i, PAT testinin diğer varyasyonlarıdır. Bu tekniklerin daha fazla modifikasyonu, yüksek çözünürlüklü poli(A) testi (Hire-PAT)19 olarak adlandırılan yüksek çözünürlüklü analiz için kılcal jel elektroforezi ile birlikte floresan etiketli primerlerin kullanımını içerir. Bu PCR güdümlü tahliller, hızlı ve yüksek hassasiyetli poli(A) uzunluk kantitasyonuna izin verir.
Yeni nesil dizilemenin geliştirilmesiyle birlikte, PAL-seq20 ve TAIL-seq21 gibi yüksek verimli bir dizileme yöntemi, transkriptom çapında bir ölçekte poliadenilasyon analizlerine izin verir. Bununla birlikte, bu yöntemler yalnızca 36-51 nükleotidin kısa dizileme okumalarını sağlar. Bu nedenle, FLAM-Seq22 , tam uzunlukta mRNA’nın küresel kuyruk uzunluğu profillemesi için geliştirilmiştir ve uzun okumalar sağlar. Nanopor teknolojisi23 , poli(A) kuyruk uzunluğu tahminleri için PCR’den bağımsız, doğrudan RNA veya doğrudan cDNA dizilimi sağlar. Ancak, bu yüksek verimli yöntemler sınırsız değildir. Büyük miktarlarda başlangıç malzemesi gerektirirler, pahalıdırlar ve zaman alıcıdırlar. Ayrıca, nadir transkriptleri analiz etmek, yüksek verimli yöntemlerle son derece zor olabilir ve düşük verimli PCR tabanlı yöntemler, pilot deneyler ve diğer yöntemlerin doğrulanması için az sayıda transkriptin analiz edilmesi gerektiğinde hala bir avantaj sağlar.
Yakın zamanda, Dscam1 mRNA’larının Drosophila’da kısa poli(A) kuyrukları içerdiğini gösterdik, bu da sitoplazmik poli(A)-bağlayıcı proteinin Dscam1 3’UTR üzerinde G/I kuyruk yöntemi24 kullanılarak kanonik olmayan bir şekilde bağlanmasını gerektirir. Burada, Drosophila sinir sistemi ve Drosophila S2 hücrelerinden mRNA’ların poli(A) uzunluğunun doku hazırlığı ve ölçülmesi için kolaylaştırılmış bir prosedür sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, Drosophila larva beynini dolaşan 3. instar aşamasından diseksiyon tekniğini ve Drosophila S2 hücrelerinden örnek hazırlamayı açıklıyoruz. mRNA’ların kararsız doğası nedeniyle, numune toplama ekstra dikkat gerektirir. Larva beyin diseksiyonu için izolasyon sırasında beyinler zarar görmemeli ve uzun süre solüsyon içinde tutulmamalıdır. Bir diseksiyon turu için diseksiyon süresini 8-10 dakika olarak tutmak esastır. Diseksiyon solüsyonunun RNAaz inhibit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü tarafından JK’ye R01NS116463 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe P20GM103650 tarafından desteklenen ve bu çalışmada bildirilen araştırmalar için kullanılan Nevada Üniversitesi, Reno’daki Hücresel ve Moleküler Görüntüleme Çekirdeği tesisi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
