Måling av poly A hale lengde fra Drosophila larve hjerne og cellelinje
Summary
Protokollen beskriver en effektiv og pålitelig metode for å kvantifisere poly(A) lengden av genet av interesse fra Drosophila-nervesystemet , som lett kan tilpasses vev eller celletyper fra andre arter.
Abstract
Polyadenylering er en avgjørende posttranskripsjonell modifikasjon som tilfører poly (A) haler til 3′-enden av mRNA-molekyler. Lengden på poly (A) halen er tett regulert av cellulære prosesser. Dysregulering av mRNA-polyadenylering har vært assosiert med unormalt genuttrykk og forskjellige sykdommer, inkludert kreft, nevrologiske lidelser og utviklingsavvik. Derfor er forståelse av dynamikken i polyadenylering avgjørende for å løse kompleksiteten i mRNA-behandling og posttranskripsjonell genregulering.
Denne artikkelen presenterer en metode for måling av poly(A) halelengder i RNA-prøver isolert fra Drosophila larvehjerner og Drosophila Schneider S2-celler. Vi benyttet guanosin / inosin (G / I) tailing tilnærming, som involverer enzymatisk tilsetning av G / I-rester ved 3′-enden av mRNA ved bruk av gjærpoly (A) polymerase. Denne modifikasjonen beskytter RNAs 3′-ende mot enzymatisk nedbrytning. De beskyttede poly(A)-halene i full lengde blir deretter reverstranskribert ved hjelp av en universell antisense-primer. Deretter utføres PCR-amplifisering ved hjelp av en genspesifikk oligo som retter seg mot genet av interesse, sammen med en universell sekvensoligo som brukes til revers transkripsjon.
Dette genererer PCR-produkter som omfatter poly (A) haler av genet av interesse. Siden polyadenylering ikke er en jevn modifikasjon og resulterer i haler av varierende lengde, viser PCR-produktene en rekke størrelser, noe som fører til et smøremønster på agarosegel. Til slutt blir PCR-produktene utsatt for høyoppløselig kapillær gelelektroforese, etterfulgt av kvantifisering ved bruk av størrelsene på poly (A) PCR-produktene og det genspesifikke PCR-produktet. Denne teknikken gir et enkelt og pålitelig verktøy for å analysere poly (A) halelengder, slik at vi kan få dypere innsikt i de intrikate mekanismene som styrer mRNA-regulering.
Introduction
De fleste eukaryote mRNA er posttranskripsjonelt polyadenylert ved deres 3′-endestasjon i kjernen ved tilsetning av ikke-malte adenosiner av kanoniske poly (A) polymeraser. En intakt poly (A) hale er sentral gjennom hele livssyklusen til mRNA, da den er viktig for mRNA kjernefysisk eksport1, letter interaksjon med poly (A) -bindende proteiner for å forbedre translasjonseffektiviteten2, og gir motstand mot nedbrytning3. I visse tilfeller kan poly (A) halen også gjennomgå forlengelse i cytoplasma, tilrettelagt av ikke-kanoniske poly (A) polymeraser4. I cytoplasma endres poly (A) halelengde dynamisk og påvirker levetiden til mRNA-molekylet. Tallrike polymeraser og deadenylaser er kjent for å modulere halelengde 5,6,7. For eksempel korrelerer forkortelsen av poly(A) haler med translasjonsundertrykkelse, mens forlengelsen av poly(A) haler forbedrer oversettelsen 8,9.
Akkumulerende genomiske studier har vist den grunnleggende betydningen av poly (A) halelengden på tvers av ulike fasetter av eukaryot biologi. Dette inkluderer roller i kimcelleutvikling, tidlig embryonal utvikling, neuronal synaptisk plastisitet for læring og minne, og den inflammatoriske responsen10. Det har vært mange metoder og analyser utviklet for måling av poly (A) halelengder. For eksempel utnytter RNase H / oligo (dT) analysen RNase H i nærvær eller fravær av oligo (dT) for å studere poly (A) hale lengde11,12. Andre metoder for å studere poly (A) hale inkluderer PCR-amplifisering av 3′ ender som rask amplifisering av cDNA ender poly (A) test (RACE-PAT) 12,13 og ligasemediert poly (A) test (LM-PAT) 14. Ytterligere modifikasjoner av PAT-analysen inkluderer ePAT15 og sPAT16. Enzymatisk G-tailing17,18 eller G/I-tailing av 3′-enden er andre variasjoner av PAT-analysen. Ytterligere modifikasjon av disse teknikkene inkluderer bruk av fluorescerende merkede primere sammen med kapillær gelelektroforese for høyoppløselig analyse, referert til som høyoppløselig poly (A) test (Hire-PAT) 19. Disse PCR-drevne analysene tillater rask og høy følsomhet poly (A) lengdekvantifisering.
Med utviklingen av neste generasjons sekvensering, tillater en høykapasitets sekvenseringsmetode, som PAL-seq20 og TAIL-seq21, polyadenyleringsanalyser i transkriptom-bred skala. Imidlertid gir disse metodene bare korte sekvenseringsavlesninger av 36-51 nukleotider. Derfor ble FLAM-Seq22 utviklet for global halelengdeprofilering av mRNA i full lengde og gir lange avlesninger. Nanopore-teknologi23 gir PCR-uavhengig, direkte RNA eller direkte cDNA-sekvensering for poly (A) halelengdeestimeringer. Imidlertid er disse metodene med høy gjennomstrømning ikke uten begrensninger. De krever store mengder startmaterialer, er dyre og tidkrevende. Videre kan analyse av sjeldne transkripsjoner være ekstremt utfordrende med høy gjennomstrømningsmetoder, og PCR-baserte metoder med lav gjennomstrømning gir fortsatt en fordel når et lite antall transkripsjoner må analyseres, for piloteksperimenter og validering av andre metoder.
Vi har nylig vist at Dscam1 mRNA inneholder korte poly(A) haler i Drosophila, noe som nødvendiggjør en ikke-kanonisk binding av det cytoplasmatiske poly(A)-bindende proteinet på Dscam1 3’UTR ved bruk av G/I-halemetoden24. Her gir vi en strømlinjeformet prosedyre for vevspreparasjon og kvantifisering av poly (A) lengde av mRNA fra Drosophila-nervesystemet og Drosophila S2-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi teknikken for å dissekere Drosophila larvehjernen fravandrende 3. stjernestadium samt prøveprepareringen fra Drosophila S2-celler. På grunn av mRNAs labile natur krever prøveinnsamling ekstra forsiktighet. Ved hjernedisseksjon av larver skal hjernen ikke skades under isolasjon og ikke oppbevares i oppløsning over lengre tid. Å holde disseksjonstiden til 8-10 min for en runde med disseksjon er viktig. Det kan også være fordelaktig å supplere disseksjon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 til JK, og Cellular and Molecular Imaging Core-anlegget ved University of Nevada, Reno, som ble støttet av National Institutes of Health Grant P20GM103650 og brukt til forskning rapportert i denne studien.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
