Misurazione della lunghezza della coda di Poly A dal cervello e dalla linea cellulare della larva di Drosophila
Summary
Il protocollo descrive un metodo efficiente e affidabile per quantificare la lunghezza del poli(A) del gene di interesse dal sistema nervoso della Drosophila , che può essere facilmente adattato a tessuti o tipi cellulari di altre specie.
Abstract
La poliadenilazione è una modificazione post-trascrizionale cruciale che aggiunge code di poli(A) all’estremità 3′ delle molecole di mRNA. La lunghezza della coda poli(A) è strettamente regolata dai processi cellulari. La disregolazione della poliadenilazione dell’mRNA è stata associata a un’espressione genica anomala e a varie malattie, tra cui cancro, disturbi neurologici e anomalie dello sviluppo. Pertanto, comprendere le dinamiche della poliadenilazione è fondamentale per svelare le complessità dell’elaborazione dell’mRNA e della regolazione genica post-trascrizionale.
Questo articolo presenta un metodo per misurare la lunghezza della coda di poli(A) in campioni di RNA isolati da cervelli larvali di Drosophila e cellule S2 di Drosophila Schneider. Abbiamo utilizzato l’approccio di coda della guanosina/inosina (G/I), che prevede l’aggiunta enzimatica di residui di G/I all’estremità 3′ dell’mRNA utilizzando la poli(A) polimerasi del lievito. Questa modifica protegge l’estremità 3′ dell’RNA dalla degradazione enzimatica. Le code protette in poli(A) a tutta lunghezza vengono quindi trascritte inversamente utilizzando un primer antisenso universale. Successivamente, l’amplificazione PCR viene eseguita utilizzando un oligo gene-specifico che ha come bersaglio il gene di interesse, insieme a un oligo di sequenza universale utilizzato per la trascrizione inversa.
Questo genera prodotti di PCR che comprendono le code di poli(A) del gene di interesse. Poiché la poliadenilazione non è una modifica uniforme e si traduce in code di lunghezza variabile, i prodotti PCR mostrano una gamma di dimensioni, portando a un modello di striscio sul gel di agarosio. Infine, i prodotti PCR vengono sottoposti a elettroforesi su gel capillare ad alta risoluzione, seguita da quantificazione utilizzando le dimensioni dei prodotti poly(A) PCR e del prodotto PCR gene-specifico. Questa tecnica offre uno strumento semplice e affidabile per l’analisi delle lunghezze della coda di poli(A), consentendoci di ottenere informazioni più approfondite sugli intricati meccanismi che regolano la regolazione dell’mRNA.
Introduction
La maggior parte degli mRNA eucariotici sono post-trascrizionalmente poliadenilati al loro terminale 3′ nel nucleo mediante l’aggiunta di adenosine non modellate da poli(A) polimerasi canoniche. Una coda di poli(A) intatta è fondamentale per tutto il ciclo di vita dell’mRNA, in quanto è essenziale per l’esportazione nucleare dell’mRNA1, facilita l’interazione con le proteine che legano il poli(A) per migliorare l’efficienza traduzionale2 e conferisce resistenza alla degradazione3. In alcuni casi, la coda di poli(A) può anche subire un’estensione nel citoplasma, facilitata dalle poli(A) polimerasi non canoniche4. Nel citoplasma, la lunghezza della coda poli (A) cambia dinamicamente e influenza la durata della vita della molecola di mRNA. Numerose polimerasi e deadenilasi sono note per modulare la lunghezza della coda 5,6,7. Ad esempio, l’accorciamento delle code di poli(A) è correlato alla repressione traslazionale, mentre l’allungamento delle code di poli(A) migliora la traduzione 8,9.
Numerosi studi genomici hanno dimostrato l’importanza fondamentale della lunghezza della coda poli(A) in vari aspetti della biologia eucariotica. Ciò include i ruoli nello sviluppo delle cellule germinali, nello sviluppo embrionale precoce, nella plasticità sinaptica neuronale per l’apprendimento e la memoria e nella risposta infiammatoria10. Sono stati sviluppati numerosi metodi e saggi per misurare le lunghezze della coda di poli(A). Ad esempio, il saggio della RNasi H/oligo(dT) sfrutta la RNasi H in presenza o assenza di oligo(dT) per studiare la lunghezza della coda della poli(A)11,12. Altri metodi per studiare la coda di poli(A) includono l’amplificazione PCR delle estremità 3′, come l’amplificazione rapida delle estremità del cDNA, il test di poli(A) (RACE-PAT)12,13 e il test di poli(A) MEDIATO DA LIGASI (LM-PAT)14. Ulteriori modifiche del test PAT includono ePAT15 e sPAT16. La coda enzimatica G17,18 o la coda G/I dell’estremità 3′ sono altre varianti del test PAT. Un’ulteriore modifica di queste tecniche include l’uso di primer marcati con fluorescenza insieme all’elettroforesi su gel capillare per l’analisi ad alta risoluzione, denominata test poli(A) ad alta risoluzione (Hire-PAT)19. Questi saggi basati sulla PCR consentono una quantificazione rapida e ad alta sensibilità della lunghezza del poli(A).
Con lo sviluppo del sequenziamento di nuova generazione, un metodo di sequenziamento ad alto rendimento, come PAL-seq20 e TAIL-seq21, consente analisi di poliadenilazione su scala a livello di trascrittoma. Tuttavia, questi metodi forniscono solo brevi letture di sequenziamento di 36-51 nucleotidi. Pertanto, FLAM-Seq22 è stato sviluppato per la profilazione globale della lunghezza della coda dell’mRNA a lunghezza intera e fornisce letture lunghe. La tecnologia Nanopore23 fornisce un sequenziamento diretto dell’RNA o del cDNA diretto indipendente dalla PCR per le stime della lunghezza della coda poli(A). Tuttavia, questi metodi ad alta produttività non sono privi di limitazioni. Richiedono grandi quantità di materiali di partenza, sono costosi e richiedono tempo. Inoltre, l’analisi di trascritti rari può essere estremamente impegnativa con metodi ad alto rendimento e i metodi basati su PCR a basso rendimento forniscono ancora un vantaggio quando è necessario analizzare un piccolo numero di trascritti, per esperimenti pilota e convalida di altri metodi.
Abbiamo recentemente dimostrato che gli mRNA di Dscam1 contengono brevi code di poli(A) in Drosophila, il che richiede un legame non canonico della proteina citoplasmatica che lega il poli(A) su Dscam1 3’UTR utilizzando il metodo di coda G/I24. Qui forniamo una procedura semplificata per la preparazione dei tessuti e la quantificazione della lunghezza dei poli(A) di mRNA dal sistema nervoso di Drosophila e dalle cellule di Drosophila S2.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo la tecnica per sezionare il cervello larvale di Drosophila dal 3° stadio di stadio errante e la preparazione del campione dalle cellule di Drosophila S2. A causa della natura labile degli mRNA, la raccolta dei campioni richiede particolare cautela. Per la dissezione cerebrale larvale, il cervello non deve essere danneggiato durante l’isolamento e non deve essere tenuto in soluzione per una durata prolungata. È essenziale mantenere il tempo di dissezione a 8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 a J.K. e dalla struttura Cellular and Molecular Imaging Core presso l’Università del Nevada, Reno, che è stata supportata dal National Institutes of Health Grant P20GM103650 e utilizzata per la ricerca riportata in questo studio.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
