ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ
Summary
特定の阻害剤をスクリーニングするための迅速かつ正確な化学アッセイは、医薬品開発の武器庫における重要なツールです。ここでは、HAT1アセチル化活性の阻害を測定するためのスケーラブルなアセチルクリックケミストリーアッセイを紹介します。
Abstract
HAT1は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1とも呼ばれ、ヌクレオソーム形成前に新生H4を安定化およびアセチル化することにより、クロマチン合成において重要な役割を果たします。さまざまなシステムでの腫瘍増殖に必要であり、がん治療の標的となる可能性があります。HAT1酵素活性を阻害する化合物の同定を容易にするために、迅速なスクリーニングのためのアセチルクリックアッセイを考案しました。この簡便なアッセイでは、活性化されたヒト細胞から精製された組換えHAT1/Rbap46を用います。この分析法では、アセチル-CoA 類似体である 4-ペンチノイル-CoA(4P)をクリックケミストリーアプローチで利用します。これには、HAT1依存性アシル化反応によるアルキンハンドルのビオチン化H4 N末端ペプチドへの酵素的転写が含まれます。捕捉したペプチドはニュートラアビジンプレート上に固定化され、続いてビオチン-アジドによるクリックケミストリー官能基化が行われます。続いて、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼリクルートメントを使用してアンプレックスレッドを酸化し、定量的な蛍光出力が得られます。アシル化反応中に化学的阻害剤を導入することで、蛍光シグナルの減少に基づいて酵素阻害を定量することができます。重要なことは、この反応はスケーラブルであり、HAT1酵素活性の潜在的な阻害剤のハイスループットスクリーニングを可能にすることです。
Introduction
数ある真核生物のアセチルトランスフェラーゼの中で、HAT1は最初に単離されたヒストンアセチルトランスフェラーゼであった1,2,3。その後の研究により、クロマチン複製、特にS期4期の新しいヌクレオソームの合成における極めて重要な役割が確固たるものとなりました。研究の結果、HAT1は乳腺細胞の上皮成長因子(EGF)処理によって高度に刺激されることが認識されました5。さらに、HAT1はin vivoでの急速な細胞増殖と腫瘍形成に必要であることが明らかになっています6,7,8,9。データによると、HAT1は細胞分裂の同化プロセスとエピジェネティックプロセスの調整に不可欠であり、腫瘍の増殖を促進します。
HAT1は、ヒストンH4のアミノ末端テールをリジン5および12上のジアセチル化し、シャペロンタンパク質Rbap46と複合体でヒストンに結合し、アミノ末端をHAT1に提示します。ヒストン四量体または二体10は、HAT1/Rbap46および他のヒストンシャペロン11とともに、核に取り込まれる。その後、ヒストンは放出され、複製フォークまたは他の部位に沈着し、遺伝子の活性化または抑制をサポートします。ヒストンH4に対するHAT1ジアセチル化マークの機能は完全には解明されていません。H4がクロマチンに挿入された後、ヒストン脱アセチル化酵素12,13,14,15の作用により、15〜30分のスパン内に迅速に除去される可能性があります。したがって、HAT1ジアセチル化マークはクロマチン中で伝播せず、真のエピジェネティックな役割を果たさない可能性があるが、新生クロマチンへのクロマチン修飾酵素の動員における役割は仮定されている12。また、HAT1はクロマチンを直接アセチル化しません。その活性は可溶性ヒストンに限定されています。
低分子ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤の開発は、非特異的で低スループットのアッセイによって妨げられており、多くの場合、生物学的に反応性化合物の生成を引き起こしています16,17。アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのゴールドスタンダードアッセイでは、3H-アセチル-coAを使用する必要があるため、スループットが制限され、放射線が必要です。それにもかかわらず、最近、CBP/p30018およびKAT6A/B19,20を標的とする特異的で非常に強力な低分子アセチルトランスフェラーゼ阻害剤が記載され、3つのH-アセチルCoAの使用によって確認されています。今後は、スループットを向上させ、実験室での危険を回避するための改良されたアッセイが考案されています。
アセチル化モニタリング21 の最近の進歩により、クリックケミストリーが利用され、酵素反応モニタリングが可能になった。クリック対応の前駆体には、単純な合成経路で入手できるものや、酵素反応に組み込むことができる購入可能なものがあります。これらの反応は通常、組換え系で行われるが、細胞ベースのアッセイも実行可能である22。クリック対応の補因子および基質の利点は、スクリーニング化合物によってしばしば摂動され、追加の取り扱いステップを必要とする結合読み出しシステムを必要とせずに、スクリーニングで酵素活性を直接測定できることです。これにより、酵素ステップ中にのみ阻害剤処理が可能になり、下流のすべての機能化および検出ステップは、化合物を除去するために広範な洗浄後に実行されるため、アッセイ干渉が発生する可能性が制限されます。これらの利点により、クリック対応アッセイの設計は、遊離コエンザイムAの検出に一般的に依存する結合アッセイよりも好ましいものになります。
重要な考慮事項の1つは、酵素活性部位へのクリック可能補因子の受け入れです。既存のクリック対応補因子は、ネイティブ補因子用に最適化されたアクティブサイトと完全に互換性がない場合があります。構造情報およびモデリングを使用して、改変された基質を取り込むために活性部位を拡大するためのアミノ酸置換を設計することができる23。これにより、酵素動態を改善し、基質と酵素のレベルを下げたスクリーニングが可能になる場合があります。このアプローチの欠点は、変化した触媒ポケットが天然酵素と強く相互作用する阻害剤を同定できない可能性があることです。最終的には、潜在的な酵素阻害剤を同定し、検証するために、複数のアプローチを組み合わせる必要があります。
ここでは、クリック補因子4-ペンチノイル-CoAを用いてHAT1酵素活性を精製およびアッセイするために開発された方法24について述べる。このアッセイ(図1)では、天然の酵素配列を、酵素活性を高めることが示されている必要なパートナータンパク質Rbap46と複合体で使用します。ヒト細胞から酵素を精製すると、 セルローの酵素活性化が可能になり、完全な酵素活性に重要な刺激的な翻訳後修飾が保存される可能性があります。ハイスループットケミカルスクリーニングのための組換え酵素アッセイの設計と最適化は、HAT1低分子阻害剤の同定と特性評価に使用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去10年間で、クリックケミストリーが顕著になり20、相互作用する化学構造の正確な設計が可能になりました。この文脈の中で、種々の生体直交共有結合21 が、それらの自然環境において複合体を形成するための有望な選択肢として浮上してきた。クリックケミストリーは、一般に「クリック反応」として知られる、迅速で選択的な反応を示す官能基のペ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H4K12CoAを提供してくださったGeorge Zheng氏に感謝します。有益な議論とフィードバックを提供してくれたGruber Labのメンバーに感謝します。NIH/NCI(1K08CA245024)、CPRIT(RR200090)、V財団(V2022-022)からの支援に感謝します。
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
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