Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos
Summary
Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.
Abstract
Los neutrófilos son células de linaje mieloide que forman una parte crucial del sistema inmunitario innato. La última década ha revelado funciones clave adicionales que desempeñan los neutrófilos en la patogénesis del cáncer, las enfermedades autoinmunes y diversas afecciones inflamatorias agudas y crónicas al contribuir al inicio y la perpetuación de la desregulación inmunitaria a través de múltiples mecanismos, incluida la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son estructuras cruciales en la defensa antimicrobiana. Las limitaciones en las técnicas para cuantificar la formación de NET de una manera imparcial, reproducible y eficiente han restringido nuestra capacidad para comprender mejor el papel de los neutrófilos en la salud y las enfermedades. Describimos un método automatizado, en tiempo real y de alto rendimiento para cuantificar neutrófilos que experimentan formación de NET utilizando una plataforma de imágenes de células vivas junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana que utiliza dos colorantes de ADN diferentes para obtener imágenes de ADN intracelular y extracelular. Esta metodología es capaz de ayudar a evaluar la fisiología de los neutrófilos y probar moléculas que pueden dirigirse a la formación de NET.
Introduction
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras de cromatina en forma de red extruidas de neutrófilos en respuesta a diversos estímulos inflamatorios. Los TNE están compuestos de ADN, histonas y varias proteínas/péptidos antimicrobianos, que atrapan y matan patógenos infecciosos e invocan respuestas inflamatorias1.
Si bien los TNE son beneficiosos para la defensa del huésped contra los patógenos, han llamado la atención como un posible impulsor de diversas enfermedades autoinmunes2, trombosis3, enfermedades metabólicas4 y crecimiento metastásico de cánceres5. Por lo tanto, la inhibición de la formación de NET es una opción terapéutica potencial para estas enfermedades. Sin embargo, a pesar de que se están desarrollando algunas moléculas prometedoras dirigidas a los NETs6, todavía no existe una terapia aprobada que afecte específicamente a este mecanismo. Esto se debe, al menos en parte, a la falta de métodos de cuantificación objetivos, imparciales, reproducibles y de alto rendimiento para la formación de NET.
Establecimos y reportamos un nuevo método que utiliza una plataforma de imágenes de células vivas de dos colores 7,8. El software analiza las imágenes de lapso de tiempo de neutrófilos teñidos con colorante nuclear permeable a la membrana y colorante de ADN impermeable a la membrana, y el número de neutrófilos antes y después de la formación de NET se cuenta en múltiples puntos de tiempo. Dado que la integridad de la membrana plasmática se pierde durante la formación de NET por la regulación deldesensamblaje de Lamin B mediado por PKCα y Lamin A/C mediado por CDK4/6 9, los neutrófilos formadores de NET se tiñen con un colorante de ADN impermeable a la membrana, mientras que los neutrófilos sanos no lo hacen. Este método supera los problemas de las técnicas previamente informadas para cuantificar la formación de NET y proporciona una cuantificación de NET imparcial, de alto rendimiento, reproducible y precisa de manera automatizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos actuales para cuantificar los NETs ex vivo tienen varios inconvenientes que limitan nuestra capacidad para estudiar neutrófilos, NETs y potenciales dianas terapéuticas de forma imparcial y de alto rendimiento10,14. Por ejemplo, el recuento directo de células formadoras de NET después de la tinción inmunofluorescente, considerado el estándar de oro para la cuantificación de NET, es de bajo rendimiento y depende de la visión subjetiva …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sección de Imágenes Ópticas de la Oficina de Ciencia y Tecnología del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
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