Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması
Summary
Destek katmanlarının kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM) ızgaralarına uygulanması, parçacık yoğunluğunu artırabilir, hava-su arayüzü ile etkileşimleri sınırlayabilir, ışın kaynaklı hareketi azaltabilir ve parçacık yönelimlerinin dağılımını iyileştirebilir. Bu belge, gelişmiş kriyo numunesi hazırlama için cryoEM ızgaralarını tek katmanlı bir grafen ile kaplamak için sağlam bir protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Kriyojenik elektron mikroskobunda (cryoEM), saflaştırılmış makromoleküller delikli bir karbon folyo taşıyan bir ızgaraya uygulanır; Moleküller daha sonra fazla sıvıyı uzaklaştırmak için lekelenir ve kabaca 1 μm genişliğinde folyo delikleri boyunca asılı duran kabaca 20-100 nm kalınlığında bir camsı buz tabakasında hızla dondurulur. Elde edilen numune, kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenir ve uygun yazılım kullanılarak görüntü işlendikten sonra, atomik çözünürlüğe yakın yapılar belirlenebilir. cryoEM’nin yaygın olarak benimsenmesine rağmen, numune hazırlama, cryoEM iş akışlarında ciddi bir darboğaz olmaya devam ediyor ve kullanıcılar genellikle asılı camsı buzda kötü davranan numunelerle ilgili zorluklarla karşılaşıyor. Son zamanlarda, cryoEM ızgaralarını, görüntülenen alandaki parçacık yoğunluğunu sıklıkla artıran ve parçacıklar ile hava-su arayüzü arasındaki etkileşimleri azaltabilen bir destek yüzeyi görevi gören tek bir sürekli grafen tabakası ile değiştirmek için yöntemler geliştirilmiştir. Burada, grafenin cryoEM ızgaralarına uygulanması ve ortaya çıkan ızgaraların bağıl hidrofilikliğinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Ek olarak, karakteristik kırınım modelini görselleştirerek grafenin varlığını doğrulamak için EM tabanlı bir yöntem açıklıyoruz. Son olarak, nispeten düşük bir konsantrasyonda saf bir numune kullanarak bir Cas9 kompleksinin 2.7 şçözünürlüklü yoğunluk haritasını hızlı bir şekilde yeniden yapılandırarak bu grafen desteklerinin faydasını gösteriyoruz.
Introduction
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM), biyolojik makromolekülleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir yönteme dönüşmüştür1. Doğrudan elektron algılama 2,3,4, veri toplama5 ve görüntü işleme algoritmaları6,7,8,9,10’daki gelişmelerle beslenen cryoEM, artık hızla artan sayıda makromolekülün atomik çözünürlüğe yakın 3D yapılarını üretebilmektedir11. Ayrıca, yaklaşımın tek moleküllü doğasından yararlanarak, kullanıcılar tek bir örnekten 12,13,14,15 birden fazla yapı belirleyebilirve heterojen yapısal toplulukları16,17 anlamak için üretilen verileri kullanma vaadini vurgulayabilir. Bu ilerlemeye rağmen, kriyo-numune ızgarası hazırlamadaki darboğazlar devam etmektedir.
CryoEM ile yapısal karakterizasyon için, biyolojik numuneler sulu çözelti içinde iyi bir şekilde dağıtılmalı ve daha sonra vitrifikasyon18,19 adı verilen bir işlemle hızlı dondurulmalıdır. Amaç, tipik olarak amorf bir karbon tabakası halinde kesilen düzenli aralıklı delikler boyunca asılı duran düzgün bir şekilde ince bir vitrifiye buz tabakasındaki parçacıkları yakalamaktır. Bu desenli amorf karbon folyo, bakır veya altın destek çubuklarından oluşan bir ağ taşıyan bir TEM ızgarası ile desteklenir. Standart iş akışlarında, ızgaralar, numunenin uygulanmasından önce bir kızdırma deşarjı plazma işlemi kullanılarak hidrofilik hale getirilir. Fazla sıvı, filtre kağıdı ile lekelenir ve protein çözeltisinin, daldırmalı dondurma sırasında kolayca vitrifiye edilebilen delikler boyunca ince bir sıvı film oluşturmasına izin verilir. Yaygın zorluklar arasında hava-su arayüzüne (AWI) partikül lokalizasyonu ve ardından denatürasyon 20,21,22 veya tercih edilen yönlerinbenimsenmesi 23,24,25, partiküllerin deliklere göç etmek yerine karbon folyoya yapışması ve partiküllerin delikler içinde kümelenmesi ve toplanmasıyer alır 26. Düzgün olmayan buz kalınlığı başka bir endişe kaynağıdır; Kalın buz, artan elektron saçılımı nedeniyle mikrograflarda daha yüksek seviyelerde arka plan gürültüsüne neden olabilirken, aşırı ince buz daha büyük parçacıkları hariç tutabilir27.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, ızgara yüzeylerini kaplamak için çeşitli ince destek filmleri kullanılmıştır, bu da parçacıkların bu desteklerin üzerinde durmasına ve ideal olarak hava-su arayüzü ile etkileşimlerden kaçınmasına izin verir. Grafen destekleri, kısmen, destek katmanı28 tarafından eklenen arka plan sinyalini azaltan minimum saçılma kesiti ile birlikte yüksek mekanik mukavemetleri nedeniyle büyük umut vaat ediyor. Grafen, arka plan gürültüsüne minimum katkısına ek olarak, dikkate değer elektriksel ve termal iletkenlik sergiler29. Grafen ve grafen oksit kaplı ızgaraların daha yüksek parçacık yoğunluğu, daha düzgün parçacık dağılımı30 ve AWI22’ye daha az lokalizasyon sağladığı gösterilmiştir. Ek olarak, grafen, aşağıdakiler için daha fazla değiştirilebilen bir destek yüzeyi sağlar: 1) ızgara yüzeyinin fizyokimyasal özelliklerini işlevselleştirme yoluyla ayarlayın 31,32,33; veya 2) ilgilenilen proteinlerin afinite saflaştırılmasını kolaylaştıran çift bağlayıcı ajanlar 34,35,36.
Bu makalede, cryoEM ızgaralarını tek bir tek tip grafen30 tabakası ile kaplamak için mevcut bir prosedürü değiştirdik. Değişiklikler, verimi ve tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla protokol boyunca şebeke kullanımını en aza indirmeyi amaçlıyor. Ek olarak, çeşitli UV/ozon tedavilerinin dalmadan önce ızgaraları hidrofilik hale getirmedeki etkinliğini değerlendirme yaklaşımımızı tartışıyoruz. Grafen kaplı ızgaralar kullanılarak kriyoEM numune hazırlamadaki bu adım kritik öneme sahiptir ve elde edilen ızgaraların nispi hidrofilikliğini ölçmek için basit yöntemimizin yararlı olduğunu gördük. Bu protokolü kullanarak, kılavuz RNA ve hedef DNA ile kompleks halinde katalitik olarak aktif olmayan S. pyogenes Cas9’un yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyonunu üreterek yapı belirleme için grafen kaplı ızgaraların kullanılmasının faydasını gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
CryoEM numune hazırlama, çoğu iş akışının, araştırmacıların kırılgan ızgaralara zarar vermemek için son derece dikkatli bir şekilde manuel olarak manipüle etmelerini gerektiren bir dizi teknik zorluk içerir. Ek olarak, herhangi bir numunenin vitrifikasyona uygunluğu tahmin edilemez; Parçacıklar genellikle hava-su-arayüzü veya ızgaraları kaplayan katı destek folyosu ile etkileşime girer, bu da parçacıkların tercih edilen yönelimleri benimsemesine veya çok yüksek protein konsantrasyonları…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Örnekler, Arnold ve Mabel Beckman Vakfı sayesinde elde edilen mikroskoplarda MIT.nano’daki CryoEM Tesisinde hazırlandı ve görüntülendi. Temas açılı görüntüleme cihazları MIT Metropolis Maker Space’de basıldı. Nieng Yan ve Yimo Han’ın laboratuvarlarına ve MIT.nano personeline bu yöntemin benimsenmesi sürecindeki destekleri için teşekkür ederiz. Özellikle, anlayışlı tartışmaları ve geri bildirimleri için Dr. Guanhui Gao ve Sarah Sterling’e teşekkürlerimizi sunuyoruz. Bu çalışma, NIH hibeleri R01-GM144542, 5T32-GM007287 ve NSF-CAREER hibe 2046778 tarafından desteklenmiştir. Davis laboratuvarındaki araştırmalar Alfred P. Sloan Vakfı, James H. Ferry Fonu, MIT J-Clinic ve Whitehead Ailesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
- Dubochet, J. Cryo-EM–the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
