ファージとロボット工学によるほぼ連続的な進化の実践ガイド

1. ハードウェアのセットアップ メモ:PRANCEシステムのハードウェアコンポーネントの概要については 図2 を、物理的に組み立てられたこれらのコンポーネントの写真については 図3 を参照してください。 リキッドハンドリング機器、プレートリーダー、補助ポンプなど、PRANCEシステムの主要なハードウェアを入手します。注:これまでのすべてのPRANCEシステムは、8チャンネルの個別アドレス指定可能なピペッティングアーム、シングルピストン96チップピペッティングアーム、プレート移動用のロボットグリッパー、チップ滅菌用の統合洗浄ステーション、吸光度と発光測定が可能な統合プレートリーダーを備えた中型から大型のリキッドハンドリング機器に実装されています。 リキッドハンドリングロボットのモデルと機能に応じて加熱方法を設定します。加熱プレートキャリアまたはヒーター媒介ロボット温度調節を使用します。 チップの再利用を可能にするために、チップ洗浄ステーションを設置します。注:これまで、PRANCEシステムは既製の洗浄ステーションを使用してきましたが、原理的には、このコンポーネントは低コストのコンポーネントから簡単に構築できます。 ケモスタット/タービドスタットとして37°Cで動作するリアルタイムバイオリアクターをセットアップすることにより、対数相で維持される細菌培養源を確立します。あるいは、37°Cの対数相(OD600 、0.25〜0.45)で、近くの冷蔵庫で4°Cで増殖した少なくとも1 Lの容量の対数相細菌培養を停止します。沈殿を防ぐために、培養物は、冷蔵または温めにかかわらず、シェーカープレートまたは攪拌プレートを使用して定期的に攪拌してください。 必要なソフトウェアとドライバーを使用してロボットを統合するために、優先ポンプを構成します。ソフトウェアを実装して、ポンプが10〜100 mLのオーダーで定義された量の液体を供給できるようにします。メモ: この実装で使用されるポンプについては、 部品表 を、これらのポンプの操作に使用するソフトウェアと、それらの構成方法に関するドキュメントについては、製造元の Web サイトを参照してください。この原稿で示したPRANCEセットアップで使用されるポンプ用のこのようなソフトウェアは、次のGitHubリポジトリでオープンソースで提供されています https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCEには、3つの別々のチャネル(バクテリアをバクテリアリザーバーに送達する、漂白剤をバクテリアリザーバーに送達する、バクテリアリザーバーを廃棄物に排出する)をポンプで送ることができる少なくとも3つのポンプマニホールドが必要であり、それぞれの速度は独立して校正および制御されます。以前、人々は水槽ポンプと水耕栽培ポンプアレイを使用してきましたが、原則として、ニシキヘビが制御できる蠕動ポンプを使用できます。重要な機能には、ロボットグリッパーを使用してプレートをリーダーに出し入れする機能、プレートリーダー測定を開始する機能、測定値にアクセスする機能が含まれます。 補足ファイル1(https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link)にあるように、少なくともバクテリアリザーバー/分配マニホールド(「ワッフル」)を含む、PRANCEシステムに必要なカスタムデッキコンポーネントを3Dプリントします。これらの容器をデッキに固定し、標準のリキッドハンドリングロボットソフトウェアを使用して位置を校正します。リザーバーをポンプアレイに接続します。注意: キャリブレーションの実行方法の詳細はロボットに依存するため、ロボットの製造元のドキュメントを参照してください。樹脂ベースの3Dプリンターが最適です。使用されるプリンタータイプの例は、 材料表に記載されています。標準のClear Resinをデフォルトのプリンタ設定で使用しました。 地域のバイオセーフティー勧告に適合するドレンをシステムに装備します。 リキッドハンドリングロボットのデッキに実験器具を置きます( 図4)。 標準的な実験室用個人用保護具(白衣、手袋、目の保護具など)の使用を含む、標準的な安全手順に従ってください。 2. ソフトウェアの準備 オープンソースのPyHamiltonリポジトリから入手できる、python11でリキッドハンドリングロボットを制御するために使用されるオープンソースソフトウェアをインストールします。https://github.com/dgretton/pyhamilton 図 4 に示すように、リキッドハンドリングロボットソフトウェアのデッキレイアウトファイルを修正およびキャリブレーションして、ロボットデッキ上のラボウェアの位置を正確に反映します。注意: ここで使用されるセットアップは、提供されたドキュメントに従って、液体処理ロボットの製造元から提供されたソフトウェアを使用します。 PRANCEロボットメソッドプログラムを シミュレーションモードで実行します。次のコマンドを使用してコマンドラインを開きます(Windowsオペレーティングシステムの場合)図 5に示すように。Windowsキー+ R「cmd」と入力します。 親ディレクトリをロボットメソッドプログラムのディレクトリに変更します。 図5に示すように、正しいパスで以下のコマンドを入力します。CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE Pythonでシミュレーションモードフラグを指定してロボットメソッドプログラムを呼び出します( 図5参照)。py robot_method.py –simulate プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します (図 5)。注記 : 先に進む前に、シミュレーションで PRANCE メソッドがエラーなしで実行できることを確認してください。スクリプトがエラーなしでシミュレーションモードで動作できるかどうかは、システムのエラー処理が呼び出されることなくメインプログラムの複数のループを完了し、メインプログラムループを終了するため、明らかになります。 シミュレーションモードを無効にして、PRANCEロボットメソッドプログラムを実行します。適切なディレクトリでコマンドラインを開きます(図5)。Windowsキー+ R「cmd」と入力します。CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE Pythonでフラグなしでロボットメソッドプログラムを呼び出します。py robot_method.py プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します。 PyHamiltonが計測器を制御し、初期化できることを確認します。 リアルタイムのデータ同期を確立します。注:これまで、PRANCEシステムは、ユーザーがリモートファイル共有ソフトウェアまたはリモートデスクトップを介してログファイルとリアルタイムのプレートリーダー測定グラフを監視できるネットワークコンピュータを使用してきました。 自動更新をオフにします。 3. 実行前の準備 計画された分析に必要なすべての培養物に対数相の細菌培養源が利用可能であり、沈降を防ぐために積極的に攪拌されていることを確認してください。活性ケモスタット/タービドスタットまたは増殖停止冷蔵増殖済み培養液を使用してください。 プログラムサイクルごとに、96ウェルラグーンの各ウェルにポンプで送る細菌培養の量(範囲0〜500 μL)の詳細でコントローラーマニフェストファイルを更新します。これにより、ラグーンの有効希釈率を正確に制御できます。これを 図 6 に示します。図 7 に示すように、DilutionCalculator.xlsxスプレッドシート(補足ファイル 2 として提供)を使用してラグーンの希釈率を計算します。 robot_method.pyファイルを目的のラグーンの高さで更新します。このプロトコルに従うには、プログラム内の変数fixed_lagoon_heightのデフォルト値として 14 (ミリメートル単位) を使用します。これは、システム上のラグーン容量 550 μL に相当しますが、使用する特定の 96 ディープウェルプレートによって異なる場合があります。 清潔なフィルターを通したピペットチップをロボットデッキの所定の位置に置き、チップラックをチップホルダーにテープで固定して、分析中の安定性を確保します。 清潔な96ウェルプレートをロボットデッキの指定された位置に配置します。 清潔な96ウェルリーダープレートをロボットデッキの指定された位置に配置します。 プレートリーダートレイが既存のプレートで占められていないことを確認します。 ポンプがコンピュータに接続され、正しいアドレスに割り当てられていることを確認します。 ポンプを作動させて漂白剤を汲み上げてから水を汲み上げて、ポンプラインを清掃します。 ポンプラインを適切なソースとアウトプットに接続し、正しいラインが関連する細菌培養物に接続されていることを確認するために細心の注意を払います。 バクテリアリザーバーとピペットチップ洗浄用の漂白剤/水を含むタンク/バケツを補充します。 甲板上のすべてのコンポーネント、特に可動要素が指定された位置で安定していることを確認してください。 ローカル実装に従って、目標温度(つまり、37°C)までヒーターを作動させます。 図8)。 UV滅菌プロトコルファイルを10分間実行して、メーカーから提供されたリキッドハンドリングロボットの内蔵UV滅菌ランプを操作します(図9)。プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します。 parametrized オプションを指定してファイルを 600 秒間実行します。 ロボット実行制御ソフトウェアが閉じていることを確認します。メモ: ロボットメソッドプログラムは、実行制御ソフトウェアの既存のインスタンスが実行されている場合にクラッシュします。 4. ハードウェアとソフトウェアの統合 「ウォーターラン」を実施し、PRANCEロボットメソッドプログラムを、すべての培養物と湿式試薬の代わりに水で一晩中実行します。注:このテストは室温で実行できます。図 5 および図 6 に示すように、ラグーンの有効希釈速度が 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記のように分析前調製を完了します。 「バクテリアイン」ラインを水の容器に接続して、給水用の対数相バクテリアを交換します。注:食品着色料を水源に追加して、実験中の液体の動きを追跡できます。 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。 新しい実行フラグ (py robot_method.py –new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、 ログ ファイル名 (TestRun)、ラグーン ウェルの数 (16)、 サイクル期間 (30)、 リーダー プレート測定あたりのサイクル数 (4)、 インデューサー ボリューム (インデューサー ボリュームは 0 ) など、要求された引数を入力しますこの試験では、アラビノースで突然変異誘発が誘導される進化の間、この値は10μLである可能性があります)、 図5に示すように。 [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムが実行されると開きます。注:PRANCE法は空のラグーンプレートを使用して開始でき、ラグーンの液体量は最初の6サイクルで最終容量に平衡化します。 バクテリオファージを含まない、目標温度での細菌培養のみでPRANCEプロトコルを一晩実行する「バクテリアのみのラン」を実施します。図 5 および図 6 に示すように、ラグーンの有効希釈速度が 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記のように分析前の前処理を完了します。目標温度が37°Cになるようにヒーターがオンになっていることを確認してください。 「バクテリアイン」ラインを、選択した対数相バクテリアの発生源に接続します。 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。 新しい実行フラグ (py robot_method.py –new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、セクション 4.1.4 で前述したように、要求された引数を入力します。 [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムの実行時に開きます。 進化したタンパク質を持つファージが、そのタンパク質を必要とする細菌で増殖するように挑戦する「感染テスト」を実行します。注:どのラグーンにファージを接種し、どのラグーンに接種しないかを事前に決定し、クロスコンタミネーションを検出するためのファージコントロールラグーンとして機能します。図 5 および図 6 に示すように、有効希釈速度 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記で詳述した分析前調製を完了します。目標温度が37°Cになるようにヒーターがオンになっていることを確認してください。 「バクテリアイン」ラインを、選択した対数相バクテリアの発生源に接続します。 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。 新しい実行フラグ (py robot_method.py –new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、セクション 4.1.4 で前述したように、要求された引数を入力します。 [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムが実行されると開きます。 バクテリオファージを添加する前に、この方法を2〜3時間実行して、ラグーンプレート内の体積とバクテリアODを平衡化します。 プログラムがスリープしているときに、実行サイクルの終わりに106 pfu/mLのバクテリオファージをウィズファージラグーンに接種します(例えば、プラークアッセイまたはqPCRによって決定された108 pfu/mLのファージアリコート5.5 μLを)、550 μLラグーンに接種します。 プログラムを一晩実行し、プラークアッセイまたはqPCRによってラグーンウェルのファージ力価を確認します。