שיטה התנהגותית רב-תכליתית לחקר ההשפעות של הורמוני בלוטת התריס על תפקוד המוח הקטן
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול למבחן התנהגות ורסטילי שפותח לאחרונה, מבחן קרן הסולם. לבדיקה זו יש יתרון של גילוי אטקסיה צרבלרית עדינה הנגרמת על ידי פגם בפעילות הורמון בלוטת התריס במערכת העצבים המרכזית על פני מבחני ההתנהגות הקונבנציונליים להערכת ביצועים מוטוריים.
Abstract
פעולת הורמון בלוטת התריס (TH) חיונית במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית, כולל המוח הקטן. במקרה של מחסור ב- TH בתחילת החיים כגון תת פעילות מולדת של בלוטת התריס, החולים מציגים הפרעות נוירולוגיות כגון פיגור קוגניטיבי וליקויים מוטוריים. ישנם מחקרים שונים המשתמשים במודלים של עכברים עם מחסור ב-TH ספציפי לרקמות או לתאים כדי לחקור את התפקיד של TH במוח הקטן. בהשוואה לעכברים מולדים עם תת-פעילות של בלוטת התריס, עכברים עם חסר TH ספציפי לתאי המוח הקטן מציגים תכונות אטקסי מתונות ומעודנות יותר, מה שמקשה על הערכת התפקוד המוטורי בעת שימוש בבדיקות קונבנציונליות כגון מבחן רוטרוד.
בשל הצורך בכלי חלופי להערכת תפקוד מוטורי במודלים של בעלי חיים הקשורים ל-TH, פיתחנו שיטה התנהגותית רב-תכליתית הנקראת “מבחן קרן הסולם”, בה אנו יכולים לתכנן את מבחני הסולם השונים בהתאם לחומרת האטקסיה בעכברי מודל. השתמשנו בעכברים טרנסגניים המבטאים קולטן TH דומיננטי-שלילי במיוחד בתא Purkinje במוח הקטן, נוירון פלט יחיד בקליפת המוח הקטן המווסת את הביצועים המוטוריים. בדיקת קרן הסולם החדשה שנבנתה זיהתה בהצלחה ליקויים חזקים בביצועים המוטוריים בעכברים הטרנסגניים ברמה גבוהה יותר בהשוואה למבחן הרוטרוד. הפרעה בלמידה המוטורית זוהתה גם במבחן קרן הסולם אך לא במבחן הרוטרוד. הפרוטוקול עם מנגנון התנהגותי חדשני זה יכול להיות מיושם על מודלים אחרים של בעלי חיים שעשויים להראות פנוטיפ אטקסי קל כדי לבחון שינויים עדינים בתפקוד המוח הקטן.
Introduction
הורמון בלוטת התריס (TH) הוא הכרחי להתפתחות המוח1. בפרט, תפקידו במוח הקטן הוא קריטי מכיוון שמחסור ב- TH בתחילת החיים גורם להתפתחות מוחית חריגה 1,2. לדוגמה בתת-פעילות מולדת של בלוטת התריס, החולים מציגים סדרה של פיגור נוירולוגי כולל ליקויים קוגניטיביים ומוטוריים3. כדי לחשוף את התפקיד של TH בהתפתחות תפקודית המוח הקטן, כמה מחקרים הגבילו את חוסר TH באופן ספציפי לתא המוח הקטן4. עם זאת, בהשוואה לעכברים מולדים כלליים של בלוטת התריס, שבהם כל הרקמות והתאים מושפעים ממחסור ב-TH, מודלים ספציפיים למוח הקטן מציגים אטקסיה כה עדינה שמבחני ההתנהגות הקונבנציונליים, כגון רוטרוד, טביעת רגל ובדיקות קרן שיווי משקל, בקושי מזהים את ההבדלים. לכן, כדי לחקור באופן מלא את השפעות TH על תפקוד המוח הקטן, יש צורך בכלי הערכה חדש כדי לזהות שינוי עדין בתיאום המוטורי של עכברי מודל.
מבחן הרוטרוד הוא הכלי הנפוץ ביותר להערכת קואורדינציה מוטורית, שפותח במקור על ידי דנהאם ומיה5 ומאוחר יותר יושם על גרסה מואצת על ידי ג’ונס ורוברטס6. ההשהיה ליפול מהמוט המסתובב מתפרשת כמבחן לתיאום מוטורי, ופשטותה ותמציתה הופכות אותה לנפוצה בקרב חוקרי התנהגות החוקרים תפקוד מוטורי7. עם זאת, קלות השימוש במבחן זה היא חרב פיפיות. מכיוון שהמוט מסתובב באופן אוטומטי, עכברים יכולים להיצמד למוט המסתובב ולהישאר עליו מבלי לזוז. יתר על כן, עכברים עשויים להתכוון ליפול במקום להמשיך לאזן על המוט המסתובב. בכל מקרה, תוקפה ומהימנותה של הבדיקה מוטלים בספק להערכת “קואורדינציה מוטורית טהורה”7. במילים אחרות, הוא אינו מכוון במדויק לתפקוד המוח הקטן וכולל גורמים אחרים כגון כוח שרירים לאחיזה.
במקום הכלים המקובלים להערכת קואורדינציה מוטורית, אנו מציגים כאן מבחן התנהגות חדשני שנקרא “מבחן קרן סולם”, שפותח לאחרונה במעבדה שלנו. מבחן ההליכה בסולם אופקי נועד להעריך יכולות מוטוריות מורכבות הקשורות למוח הקטן: חיזוי הזנה קדימה ואינטגרציה של תנועה8. מכשיר הבדיקה היה מורכב מארבע חתיכות פרספקס עם חורים (איור 1). ארבעת הלוחות חוברו במקביל באמצעות ברגים ומקלות שהוכנסו לחורים שעל הלוחות. שני לוחות חיצוניים שימשו לייצוב המכשיר ושני לוחות פנימיים שימשו לתכנון סוגים שונים של מדרגות סולם (איור 2C). רוחב המדרגה הותאם בהתאם לגודל החיה כדי למזער את תנועתן לאחור של החיות (איור 2B). המרחק מנקודת ההתחלה לשער היה 110 ס”מ. המכשיר היה ממוקם 60 ס”מ מעל הספסל וכרית בטיחות הונחה מתחת למכשיר (איור 2A). החדר החשוך הוצב ליד המטרה כדי להניע את החיות לנוע לעבר המטרה (איור 2A).
בחנו את השפעות TH על ההתפתחות התפקודית של המוח הקטן באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים קולטן TH דומיננטי-שלילי (TR) בתאי Purkinje במוח הקטן (עכברי Mf-1/FVB). הן בבדיקות רוטרוד והן בבדיקות קרן סולם, ראינו פנוטיפ אטקסי צרבלרי בעכברי Mf-1/FVB; עם זאת, בדיקת קרן הסולם הצליחה לזהות הבדלים משמעותיים יותר מאשר בדיקת רוטרוד (איור 3). נוסף על כך, ניתן להעריך באופן יסודי יותר את יכולת הלמידה המוטורית במבחן קרן סולם (איור 3B,C). כרקע תאי של פנוטיפ התנהגותי כזה, עוכבה השראת דיכאון לטווח ארוך (LTD) ובמקום זאת, הגברה לטווח ארוך (LTP) הושרה בעקבות גירוי השראתי LTD בתאי פורקיניה Mf-1/FVB9. LTD חיוני לתיאום מוטורי ולמידה מוטורית במוח הקטן10. מחקרים רבים דיווחו על ליקויים מוטוריים ועיכוב של LTD בעכברי נוקאאוט או מוטציה עבור גנים מווסתים מרכזיים בתפקוד המוח הקטן, עם זאת, מעולם לא דווח על השראת LTP בעקבות גירוי השראתי LTD11,12. יחד, תופעה זו עשויה להיות ייחודית לעכברי Mf-1/FVB או עכברים עם מחסור ב-TH (אותה תופעה נצפתה בעכברים בוגרים עם תת-פעילות של בלוטת התריס), דבר המצביע על כך ש-TH מווסת את תפקוד המוח הקטן באופן שונה מחלבוני מפתח אחרים. אם כן, סביר להניח שעכברים עם פעולת TH חריגה אינם מציגים אטקסיה צרבלרית באותו אופן כמו עכברי מודל אחרים. זה שוב מדגיש את הצורך בשיטה ספציפית להערכת השפעות TH על תפקוד המוח הקטן. מאמר זה מציג פרוטוקול חדשני לחקר השפעות TH על תפקוד המוח הקטן באמצעות בדיקת קרן הסולם החדשה שנבנתה.
Protocol
Representative Results
Discussion
התכנון שלנו הסתמך על מחקר עבר של מץ ווישאו, שדיווחו על התועלת של “מבחן ההליכה שלב הסולם”13,14. הם תכננו את מבחן ההליכה שלב הסולם כדי להעריך הליכה מיומנת ולמדוד הן את מיקום הגפיים הקדמיות והאחוריות, דריכה ותיאום בין הגפיים על ידי דרישה מבעלי חי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע KAKENHI (מענק מס’ 18H03379 לנ.ק., 21K15340 ל- I.A. ו- 22J11280 ל- A.N).
Materials
| Air puff | DAISO | ||
| Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
| Screws | CAINZ |
References
- Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
- Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
- Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17 (2010).
- Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342 (2022).
- Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
- Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119 (2022).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
- Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118 (2021).
- Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010 (2022).
- Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
- Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).
