Куркуминоид-опосредованная антимикробная фотодинамическая терапия на мышиной модели кандидоза полости рта
Summary
Этот протокол описывает применение антимикробной фотодинамической терапии (ФДТ) на мышиной модели кандидоза полости рта. ФДТ проводили с использованием водорастворимой смеси куркуминоидов и синего светодиодного света.
Abstract
Антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ) была широко исследована in vitro, а доклинические модели инфекций на животных подходят для оценки альтернативных методов лечения до клинических испытаний. В этом исследовании описывается эффективность аФДТ на мышиной модели кандидоза полости рта. Сорок мышей были иммуносупрессивно введены с помощью подкожных инъекций преднизолона, а их языки были инокулированы с помощью мазка из ротовой полости, предварительно смоченного в клеточной суспензии C. albicans . В ходе эксперимента тетрациклин вводили с питьевой водой. Через пять дней после инокуляции грибка мыши были случайным образом распределены на восемь групп; Девятая группа необработанных неинфицированных мышей была включена в качестве отрицательного контроля (n = 5). Три концентрации (20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ) смеси куркуминоидов были протестированы с синим светодиодным светом (89,2 мВт/см2; ~455 нм) и без света (группы C+L+ и C+L- соответственно). В качестве контрольной группы оценивали только свет (C-L+), отсутствие лечения (C-L-) и животных без инфекции. Данные анализировали с помощью тестов Уэлча ANOVA и Геймса-Хауэлла (α = 0,05). Кандидоз полости рта был установлен у всех инфицированных животных и визуализировался макроскопически по наличию характерных белых пятен или псевдомембран на тыльной стороне языка. Гистопатологические срезы подтвердили большое присутствие дрожжей и филаментов, ограниченных ороговевшим слоем эпителия в группе C-L-, а присутствие грибковых клеток было визуально снижено на изображениях, полученных от мышей, подвергшихся ФДТ куркуминоидами 40 мкМ или 80 мкМ. ФДТ, опосредованная 80 мкМ куркуминоидами, способствовала снижению количества колоний на 2,47 log10 по сравнению с таковыми в группе C-L- (p = 0,008). Во всех остальных группах не было выявлено статистически значимого снижения количества колоний, включая группы фотосенсибилизаторов (C+L-) или только света (C-L+). Куркуминоид-опосредованная аФДТ снижала грибковую нагрузку от языков мышей.
Introduction
Кандидоз полости рта (ОК) – основная грибковая инфекция ротовой полости; это вызвано чрезмерным ростом Candida spp. Предрасполагающие факторы к ОК включают эндокринную дисфункцию, применение антибиотиков широкого спектра действия, радио- и химиотерапию, дефицит питательных веществ, ксеростомию (низкий поток слюны), ношение зубных протезов, плохую гигиену и, особенно, иммуносупрессию1. Среди видов Candida Candida albicans является наиболее распространенным и вирулентным; Он обнаруживается в организме человека как комменсальный вид и как условно-патогенный микроорганизм. C. albicans обладает способностью изменять свою морфологию от комменсальных дрожжей (бластопоров) до патогенных филаментов (гиф и псевдогиф)2. Нитевидные формы, особенно гифы, могут проникать в эпителий хозяина путем эндоцитоза или активного проникновения, вызывая инфекцию3. Другие факторы вирулентности C. albicans включают адгезию, образование биопленки и секрецию липолитических и гидролитических ферментов и токсинов, таких как липазы, фосфолипазы, протеиназы и кандидализин4.
Лечение ОК включает использование противогрибковых средств, особенно топических полиенов и азолов (нистатин и миконазол)5. Тем не менее, они показывают только краткосрочную эффективность, и часто рецидивируют. Кроме того, чрезмерное использование противогрибковых препаратов породило проблему развития и распространения устойчивости к противогрибковымпрепаратам6. Поэтому необходимы альтернативные методы лечения, такие как антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ), которая сочетает в себе фотосенсибилизатор (ФС) и свет с соответствующей длиной волны (такой же, как и у поглощения ФС) в присутствии кислорода. ФС связываются с клетками или поглощаются ими и при активации светом продуцируют активные формы кислорода (АФК), которые токсичны для сенсибилизированных клеток7.
В ФДТ одним из фотосенсибилизаторов (ФС) является куркумин (CUR), природное соединение, извлеченное из корневищ растения куркумы (Curcuma longa L.). Куркумин обладает многочисленными терапевтическими свойствами, включая противовоспалительные, антиоксидантные, противораковые и противомикробные свойства 8,9. Предыдущее исследование показало, что ФДТ с использованием CUR эффективно уменьшает C. albicans в мышиной модели кандидоза полости рта, не причиняя никакого вреда тканям хозяина10. CUR является основным куркуминоидом, извлекаемым из куркумы, но в этом растении также содержатся другие полифенолы, такие как деметоксикуркумин и бис-деметоксикуркумин. Куркуминоид-опосредованная аФДТ продемонстрировала антибактериальную активность в отношении биопленок золотистого стафилококка, выращенных в катетерах11. Однако, насколько нам известно, его противогрибковая активность в отношении C. albicans остается неясной. Таким образом, в этом исследовании мы оценили аФДТ, опосредованную куркуминоидной солью, против C. albicans в мышиной модели ОК.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans ассоциировался с инфекциями полости рта и пищевода у лиц с ослабленным иммунитетом, сахарным диабетом, длительным приемом антибиотиков и плохой гигиеной полости рта 1,3. Изучение инфекционных заболеваний человека требует исследований как in…
Acknowledgements
Авторы благодарят за финансовую поддержку FAPESP (Исследовательский фонд Сан-Паулу, номер процесса FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) и 2008/00601-6. Мы также благодарим доктора Ану Паулу Сильва за предоставленную информацию о водорастворимой соли на основе CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).
- Marôco, J. . Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
