Curcuminoïde-gemedieerde antimicrobiële fotodynamische therapie op een muizenmodel van orale candidiasis
Summary
Dit protocol beschrijft de toepassing van antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) in een muizenmodel van orale candidiasis. aPDT werd uitgevoerd met behulp van een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden en blauw LED-licht.
Abstract
Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) is uitgebreid in vitro onderzocht en preklinische diermodellen van infecties zijn geschikt voor het evalueren van alternatieve behandelingen voorafgaand aan klinische onderzoeken. Deze studie beschrijft de werkzaamheid van aPDT in een muizenmodel van orale candidiasis. Veertig muizen werden immuunonderdrukt met subcutane injecties van prednisolon en hun tongen werden geïnoculeerd met behulp van een oraal wattenstaafje dat eerder was gedrenkt in een C. albicans-celsuspensie . Tetracycline werd in de loop van het experiment via drinkwater toegediend. Vijf dagen na schimmelinenting werden muizen willekeurig verdeeld in acht groepen; Een negende groep onbehandelde niet-geïnfecteerde muizen werd opgenomen als negatieve controle (n = 5). Drie concentraties (20 μM, 40 μM en 80 μM) van een mengsel van curcuminoïden werden getest met een blauw LED-licht (89,2 mW/cm2; ~455 nm) en zonder licht (respectievelijk C+L+ en C+L-groepen). Alleen licht (C-L+), geen behandeling (C-L-) en dieren zonder infectie werden als controles beoordeeld. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Welch’s ANOVA- en Games-Howell-tests (α = 0,05). Orale candidiasis werd vastgesteld bij alle geïnfecteerde dieren en macroscopisch gevisualiseerd door de aanwezigheid van karakteristieke witte vlekken of pseudomembranen op het dorsum van de tongen. Histopathologische secties bevestigden een grote aanwezigheid van gist en filamenten beperkt tot de verhoornde laag van het epitheel in de C-L-groep, en de aanwezigheid van schimmelcellen was visueel verminderd in de beelden verkregen van muizen die werden onderworpen aan aPDT met curcuminoïden van 40 μM of 80 μM. aPDT gemedieerd door 80 μM curcuminoïden bevorderde een vermindering van 2,47 log10 in het aantal kolonies in vergelijking met die in de C-L-groep (p = 0,008). Alle andere groepen vertoonden geen statistisch significante vermindering van het aantal kolonies, inclusief fotosensibiliserende (C+L-) of alleen licht (C-L+) groepen. Curcuminoïde-gemedieerde aPDT verminderde de schimmelbelasting van de tongen van muizen.
Introduction
Orale candidiasis (OC) is de belangrijkste schimmelinfectie van de mondholte; het wordt veroorzaakt door de overgroei van Candida spp. Predisponerende factoren voor OC zijn onder meer endocriene disfunctie, het gebruik van breedspectrumantibiotica, radio- en chemotherapie, voedingstekorten, xerostomie (lage speekselvloed), gebruik van kunstgebitten, slechte hygiëne en vooral immunosuppressie1. Van de Candida-soorten is Candida albicans de meest voorkomende en virulente; Het wordt aangetroffen als een commensale soort in het menselijk lichaam en als een opportunistische ziekteverwekker. C. albicans heeft het vermogen om zijn morfologie te veranderen van commensale gisten (blastopores) naar pathogene filamenten (hyfen en pseudohyfen)2. De filamenteuze vormen, vooral de hyfen, kunnen het epitheel van de gastheer binnendringen door endocytose of actieve penetratie, waardoor infectie ontstaat3. Andere virulentiefactoren van C. albicans zijn adhesie, biofilmvorming en secretie van lipolytische en hydrolytische enzymen en toxines, zoals lipasen, fosfolipasen, proteïnasen en candidalysine4.
OC-behandelingen omvatten het gebruik van antischimmelmiddelen, met name lokale polyenen en azolen (nystatine en miconazol)5. Ze vertonen echter alleen werkzaamheid op korte termijn en recidiveren komen vaak voor. Bovendien heeft het overmatig gebruik van antischimmelmiddelen geleid tot het probleem van de ontwikkeling en verspreiding van antischimmelresistentie6. Daarom zijn alternatieve therapieën nodig, zoals antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT), die een fotosensibilisator (PS) en licht combineert op een geschikte golflengte (dezelfde als die van de PS-absorptie) in aanwezigheid van zuurstof. PS’s worden gebonden aan of opgenomen door cellen en produceren, wanneer ze door licht worden geactiveerd, reactieve zuurstofsoorten (ROS) die giftig zijn voor gesensibiliseerde cellen7.
Bij aPDT is een van de gebruikte fotosensibilisatoren (PS’s) curcumine (CUR), een natuurlijk voorkomende verbinding die wordt gewonnen uit de wortelstokken van de kurkumaplant (Curcuma longa L.). Curcumine bezit tal van therapeutische eigenschappen, waaronder ontstekingsremmende, antioxiderende, kankerbestrijdende en antimicrobiële eigenschappen 8,9. Uit een eerder onderzoek bleek dat aPDT met behulp van CUR C. albicans effectief verminderde in een muizenmodel van orale candidiasis zonder schade toe te brengen aan de weefsels van de gastheer10. CUR is de belangrijkste curcuminoïde die wordt gewonnen uit kurkuma, maar andere polyfenolen, zoals demethoxycurcumine en bis-demethoxycurcumine, worden ook in deze plant aangetroffen. Curcuminoïde-gemedieerde aPDT toonde antibacteriële activiteit aan tegen biofilms van Staphylococcus aureus gekweekt in katheters11. Voor zover wij weten, blijft de schimmelwerende werking tegen C. albicans echter onduidelijk. Daarom evalueerden we in deze studie aPDT gemedieerd door een curcuminoïde zout tegen C. albicans in een muizenmodel van OC.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans is in verband gebracht met orale en slokdarminfecties bij personen met een immuungecompromitteerde toestand, diabetes mellitus, langdurig gebruik van antibiotica en slechte mondhygiëne 1,3. De studie van menselijke infectieziekten vereist zowel in vitro als in vivo onderzoek voordat klinische proeven veilig en nauwkeurig kunnen worden opgezet. De huidige studie beschrijft een methode voor het opstellen van een muizenmodel v…
Acknowledgements
De auteurs danken de financiële steun van FAPESP (São Paulo Research Foundation, procesnummer FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) en 2008/00601-6. We danken ook Dr. Ana Paula Silva voor het verstrekken van de informatie over het op water oplosbare zout op basis van CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).
- Marôco, J. . Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
