גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים
Summary
מחקר זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים באמצעות המסת קרישי דם, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית.
Abstract
פקקת מוחית, קריש דם בעורק מוחי או בווריד, הוא הסוג הנפוץ ביותר של אוטם מוחי. חקר מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים חשוב לאבחון, טיפול ופרוגנוזה. עם זאת, הגישות הנוכחיות לחקר מרכיבי התא של קרישי הדם מבוססות בעיקר על צביעה באתרה , שאינה מתאימה למחקר מקיף של מרכיבי התא מכיוון שהתאים עטופים היטב בקרישי הדם. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה אנזים פיברינוליטי (sFE) מ-Sipunculus nudus, שיכול לפרק את הפיברין הצולב, באופן ישיר, ולשחרר את מרכיבי התא. מחקר זה ביסס שיטה מקיפה המבוססת על sFE לחקר מרכיבי התא של פקקת מוחית. פרוטוקול זה כולל המסת קרישי דם, שחרור תאים, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית. על פי שיטה זו, ניתן היה לחקור את מרכיבי התא באופן כמותי ואיכותי. התוצאות המייצגות של ניסויים בשיטה זו מוצגות.
Introduction
מחלת כלי דם במוח היא אחת משלוש מחלות עיקריות שיכולות לאיים על בריאות האדם, ביניהן מחלת כלי דם איסכמית במוח מהווה יותר מ -80%. פקקת מוחית ופקקת ורידים מוחיים הן מחלות כלי הדם האיסכמיות המודאגות ביותר כיום, הנגרמות בעיקר על ידי קרישי דם מוחיים 1,2. אם הטיפול לא נעשה כראוי, יהיו לו שיעורי נכות ותמותה גבוהים ושיעור הישנות גבוה לאחר השחרור3.
לאחרונה, מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים נמצאים בקורלציה הדוקה עם האבחון, הטיפול והפרוגנוזה של פקקת מוחית 4,5,6. לכן, זמינות הנתונים על הרכב פקקת, במיוחד מרכיבי התא, חשובה לאבחון קליני וטיפול. למרבה הצער, השיטות הקיימות כיום אינן יכולות לנתח באופן מקיף את מרכיב קריש הדם באופן כמותי ואיכותי. לדוגמה, צביעה באתרו המבוססת על Martius Scarlett Blue יכולה לחקור רק את תאי הדם האדומים/לבנים של פרוסות מסוימות של קריש הדם7. צביעה באתרו המבוססת על אימונוהיסטוכימיה (IHC) יכולה לחקור רק רכיבי דם מוגבלים של פרוסות מסוימות של הקרישבאמצעות נוגדנים 8. השיטות המיקרוסקופיות מבוססות התמונה עוסקות רק במבנה הספציפי של קריש9. יתר על כן, כל השיטות האלה הן מייגעות וגוזלות זמן10. עד כה, לא דווחו ההליכים ללימוד כמותי ואיכותי של מרכיבי תאי תרומבי מוחיים. ידוע כי הפיברין הצולב עוטף בחוזקה את תאי הדם בקרישי הדם11. כתוצאה מכך, הפירוק הספציפי של הפיברין הצולב, ושחרור התאים השלמים, הוא קריטי לניתוח מדויק של מרכיבי התא.
עבודות קודמות בודדו אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus (sFE), שיכול לפרק את הפיברין באופן ספציפי ומהיר12. כאן הוצעה שיטה לניתוח מרכיבי התא של תרומבי המוח בהתבסס על הפעילות הייחודית של sFE. פרוטוקול זה השתמש ב- sFE כדי לפרק את הפיברין של קרישי דם תחילה ולאחר מכן ניתח את מרכיבי התא על ידי צביעת רייט ובדיקת דם שגרתית13,14. על פי שיטה זו, ניתן ללמוד כמותית ואיכותית את מרכיבי התא של תרומבי מוחי. פרוטוקול פשוט ויעיל זה עשוי להיות מיושם עבור ניתוח רכיבי התא של קרישי דם אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE הוא סוכן פיברינוליטי שיכול לפרק את הפיברין באופן ישיר ויעיל12,16. כאן, נעשה שימוש ב-sFE כדי לפרק את הפיברין הצולב-מקושר של קרישי הדם במוח, לשחרר את התאים הסגורים בתוך קרישי הדם, ולנתח את מרכיבי התאים של הקרישים באופן איכותי וכמותי. נתוני המיקרוסקופ ובדיקת הדם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197), ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג’יאן (מס ‘2019J01070, מס ‘2021Y0027).
Materials
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a., Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
