نهج شامل لتحليل مكونات الخلايا من جلطات الدم الدماغية
Summary
تصف هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الدماغية من خلال إذابة الجلطة وتلطيخ الخلايا وفحص الدم الروتيني.
Abstract
الجلطة الدماغية ، وهي جلطة دموية في الشريان أو الوريد الدماغي ، هي أكثر أنواع الاحتشاء الدماغي شيوعا. دراسة مكونات الخلية من جلطات الدم الدماغية مهمة للتشخيص والعلاج والتشخيص. ومع ذلك ، فإن الأساليب الحالية لدراسة مكونات الخلية في الجلطات تعتمد بشكل أساسي على التلوين في الموقع ، وهو أمر غير مناسب للدراسة الشاملة لمكونات الخلية لأن الخلايا ملفوفة بإحكام في الجلطات. نجحت الدراسات السابقة في عزل إنزيم محلل للفبرين (sFE) من Sipunculus nudus ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تحلل الفيبرين المتصالب مباشرة ، وإطلاق مكونات الخلية. أنشأت هذه الدراسة طريقة شاملة تعتمد على sFE لدراسة مكونات الخلية في الخثرة الدماغية. يتضمن هذا البروتوكول إذابة الجلطة ، وإطلاق الخلايا ، وتلطيخ الخلايا ، وفحص الدم الروتيني. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية كميا ونوعيا. يتم عرض النتائج التمثيلية للتجارب باستخدام هذه الطريقة.
Introduction
الأمراض الدماغية الوعائية هي واحدة من ثلاثة أمراض رئيسية يمكن أن تهدد صحة الإنسان ، من بينها الأمراض الدماغية الوعائية التي تمثل أكثر من 80 ٪. تجلط الدم الدماغي وتجلط الأوردة الدماغية هي أكثر الأمراض الدماغية الوعائية الإقفارية اليوم ، والتي تسببها بشكل رئيسي جلطات الدم الدماغية 1,2. إذا لم يتم العلاج بشكل صحيح ، فسيكون له معدلات عالية من الإعاقة والوفيات ومعدل تكرار مرتفع بعد الخروج3.
في الآونة الأخيرة ، أظهر عدد متزايد من الدراسات أن مكونات الخلايا في جلطات الدم الدماغية ترتبط ارتباطا وثيقا بتشخيص وعلاج وتشخيص تجلط الدم الدماغي4،5،6. لذلك ، فإن توافر البيانات حول تكوين الجلطة ، وخاصة مكونات الخلية ، مهم للتشخيص والعلاج السريري. لسوء الحظ ، لا يمكن للطرق المتاحة حاليا تحليل مكون جلطة الدم بشكل شامل كميا ونوعيا. على سبيل المثال ، يمكن للتلطيخ في الموقع القائم على Martius Scarlett Blue فقط دراسة خلايا الدم الحمراء / البيضاء لشرائح معينة من الجلطة7. يمكن للتلوين في الموقع القائم على الكيمياء المناعية (IHC) دراسة مكونات الدم المحدودة لشرائح معينة من الجلطة باستخدام أجسامهاالمضادة 8. تهتم الطرق المجهرية القائمة على الصور فقط بالبنية المحددة للجلطة9. علاوة على ذلك ، كل هذه الأساليب شاقة وتستغرق وقتاطويلا 10. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن إجراءات دراسة مكونات خلايا الجلطات الدماغية كميا ونوعيا. من المسلم به على نطاق واسع أن الفيبرين المتصالب يلف خلايا الدم بإحكام في الجلطات11. وبالتالي ، فإن التدهور المحدد للفيبرين المتصالب وإطلاق الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق لمكونات الخلية.
قامت الأعمال السابقة بعزل إنزيم محلل للفبرين من Sipunculus nudus (sFE) ، والذي يمكن أن يتحلل الفيبرين على وجه التحديد وبسرعة12. هنا ، تم اقتراح طريقة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدماغية بناء على النشاط الفريد ل sFE. استخدم هذا البروتوكول sFE لتحلل الفيبرين من الجلطات أولا ثم تحليل مكونات الخلية عن طريق تلطيخ رايت وفحص الدمالروتيني 13،14. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية من الجلطات الدموية الدماغية كميا ونوعيا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والفعال لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE هو عامل تحلل الفيبرين الذي يمكن أن يحلل الفيبرين مباشرة وفعالية12,16. هنا ، تم استخدام sFE لتحلل الفيبرين المتصالب للجلطات الدموية الدماغية ، وإطلاق الخلايا المغلقة داخل الجلطات ، وتحليل مكونات الخلية للجلطات نوعيا وكميا. أشارت بيانات الفحص المجهري وفحص ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ، ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).
Materials
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a., Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
